白藜芦醇抑制乳腺干细胞效应及机制研究
乳腺癌高居女性恶性肿瘤发病率的榜首，占所有新发女性恶性肿瘤的29％，全世界每年约有70000新病例诊断出患有乳腺癌。尽管乳腺癌的诊断技术和治疗技术已经十分先进，但是乳腺癌的致死率仍然很高。因乳腺癌死亡的病例数仅次于肺癌，位居第二，占所有死于恶性肿瘤女性的14％。据美国国家癌症研究院报告，预防是减小乳腺癌患病率至关重要的一个环节。 肿瘤干细胞假说认为癌症是由比例非常小的一部分干细胞引起的。肿瘤干细胞拥有自我更新和生成肿瘤的能力。肿瘤干细胞的概念对于肿瘤预防和治疗策略方面具有深远的临床意义。这个假说很好的建立，源于肿瘤初始细胞的识别和非肥胖糖尿病联合严重免疫缺陷小鼠移植模型实验。关于乳腺癌干细胞最初的发现，揭示了人乳腺癌细胞中带有细胞表面标记ESA+/CD44+/CD24-/low特征的细胞亚群，具有高度致瘤性。很少量的细胞，可以是200个标记为ESA+/CD44+/CD24-/low的细胞，或者是1000个标记为CD44+/CD24-/low的细胞，在异体移植到非肥胖糖尿病联合严重免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠上后，均能成瘤。如果不经过荧光标记流式分选，需要超过50000个细胞才能异体移植成瘤。后来研究发现乙醛脱氢酶也能够作为乳腺癌干细胞(Breastcancer stem-like cells，BCSCs)和正常乳腺干细胞的标记物。肿瘤干细胞能够依靠标记物分离出来，促进了对其分子机制的研究，包括来源、自我更新、分化成癌细胞、放疗化疗抵抗、侵袭性和转移性等。乳腺癌干细胞的临床分析结果表明肿瘤干细胞的比例和不良预后存在相关性。因此，迫切需要建立特别针对肿瘤干细胞的化学预防和治疗措施。 因为膳食中富含具有减少癌症风险的植物性食物，所以越来越多的兴趣放在可作为潜在化学预防试剂的水果蔬菜中营养成分和非营养成分的分离和描述其特征上。天然白藜芦醇，化学式为反式-3，4'，5-三羟基-二苯基乙烯，是多酚类化合物，主要来源于葡萄、红酒、浆果、花生、虎杖、桑椹等植物性食物。研究表明白藜芦醇具有抗氧化、抗炎症、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等广谱药理生物活性。白藜芦醇的抗肿瘤功效，反映在调节肿瘤的不同阶段:致癌期、癌症早期、癌症发展期、癌症转移期。但是白藜芦醇抗癌效应的潜在分子机制还没有完全阐述清楚。 鉴于在乳腺致癌和癌症发展中肿瘤干细胞的重要作用，深入研究白藜芦醇对乳腺癌干细胞的作用，并探讨相关分子作用机制，对于揭示揭示白藜芦醇抑癌机理具有重要理论和现实意义。 本研究评价和研究白藜芦醇抑制乳腺癌干细胞的抑制效应及其分子机制。首先采用乙醛脱氢酶1联合7AAD标记乳腺癌细胞MCF-7和SUM159，流式细胞术分选得到乙醛脱氢酶阳性乳腺癌干细胞群。再用体外实验评价白藜芦醇对乳腺癌干细胞的作用。CCK-8实验检验不同浓度的白藜芦醇处理人正常乳腺上皮细胞MCF10A和人乳腺癌细胞MCF-7和SUM15924小时后细胞毒性。CCK-8实验检验不同浓度白藜芦醇处理从MCF-7和SUM159细胞中分离的乳腺癌干细胞24小时后细胞毒性。流式细胞术分析不同浓度白藜芦醇处理SUM159和MCF-7细胞24小时后，其乙醛脱氢酶阳性比例。微球体培养实验检验不同浓度白藜芦醇处理乳腺癌干细胞7天后，成微球的大小和数量。然后用体内动物实验评价白藜芦醇对乳腺癌干细胞的作用，采用非肥胖型糖尿病联合严重免疫缺陷小鼠二次成瘤模型，异体移植5×106个肿瘤细胞SUM159到五周龄雌性小鼠脂肪垫下成瘤，两周后腹腔注射白藜芦醇（100mg/kg/d）和生理盐水，连续两周，每两天观察测量一次移植瘤大小。人道处死小鼠，剥离肿瘤，用机械力或酶的作用消化分散成肿瘤单细胞，流式细胞术分析部分单细胞中乙醛脱氢酶阳性比例，剩余单细胞分为对照组和白藜芦醇用药组，同时注射入第二批小鼠左侧和右侧的脂肪垫，生长30天，观察并测量小鼠的肿瘤大小。最后探讨白藜芦醇对乳腺癌干细胞作用的分子机制，用质粒转染、激光共聚焦、扫描电镜以及蛋白免疫印迹等方法进行研究关于白藜芦醇抑制乳腺癌干细胞的分子机制。 实验结果: (1)白藜芦醇(10-40μmol/L)显著降低SUM159和MCF-7的细胞活力，对MCF10A几乎没有细胞毒性。白藜芦醇降低人乳腺癌细胞SUM159和MCF-7中乙醛脱氢酶阳性细胞(BCSCs)比例，减小无血清诱导微球体培养的大小及数目。 (2)非肥胖糖尿病联合严重免疫缺陷小鼠异体移植瘤，与对照组相比，白藜芦醇用药组由体重变化看出白藜芦醇几乎无细胞毒性，却能通过肿瘤体积变化看出明显抑制移植肿瘤的生长，且降低了肿瘤中乙醛脱氢酶1阳性比率。从肿瘤中分散单细胞进行二次成瘤，小鼠生长30天后，6只小鼠中仅1只用药组移植肿瘤生长，而6只中对照组移植肿瘤全部生长。 (3)扫描电镜观察白藜芦醇处理从SUM159和MCF-7中分离的乳腺癌干细胞，与对照组相比，细胞内自噬体数量明显增加;GFP-LC3-Ⅱ质粒转染激光共聚焦观察可见绿色荧光小点数，白藜芦醇处理组明显高于对照组;Westren blotting检测自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg7表达均随白藜芦醇浓度增加而增加，表明白藜芦醇诱导乳腺癌干细胞自噬的发生。 (4) Westren blotting检测Wnt/β-catenin关键性蛋白cyclin1和β-catenin，这两种蛋白表达均随白藜芦醇浓度增加而降低，免疫化学检测证明白藜芦醇的处理降低了cyclin1和β-catenin的表达，表明白藜芦醇抑制乳腺癌干细胞的Wnt/β-catenin信号通路;通过质粒转染过表达β-catenin、自噬抑制剂CQ分别与白藜芦醇联合使用，能降低BCSCs比例，减少白藜芦醇对BCSCs的细胞毒性，显著抑制白藜芦醇诱导的BCSCs自噬，表明白藜芦醇至少部分是通过下调Wnt/β-catenin信号通路诱导BCSCs自噬的。 全文结论:白藜芦醇在体内外均可有效抑制BCSCs，其机制涉及通过下调Wnt/β-catenin自我更新信号通路诱导BCSCs自噬发生。
白藜芦醇;乳腺癌;异体移植;抗癌效应
第三军医大学
博士
营养与食品卫生学
糜漫天
2014
中文
R737.9
122
2015-06-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）