基于不同长度的COI和COII基因片段分子鉴定嗜尸性双翅目昆虫
一、季节性演替实验鉴定法医学重要节肢动物 背景: 法医昆虫学(forensic entomology)研究内容主要是对在尸体内、尸体表面或尸体附近采集到的昆虫标本，进行检验、鉴定、分类后，明确昆虫种类或确定某一昆虫生长发育状态，结合昆虫在尸体上的生态群落演替，帮助法医完成死亡时间(postmortem interval，PMI)的推断。昆虫在尸体上是按一定的次序出现并繁殖。目前，在埃及有关不同腐败阶段的动物区系演替实验和他们在法律上应用报道还很少。而且，也没有埃及东北部有关法医重要意义昆虫的数据报道。 目的： 1.第一次在埃及东北部(32°15′E，30°36′N)调查法医重要性意义的昆虫。 2.调查冬夏季节动物尸体上的主要昆虫类群，并分析尸体分解速度的季节性差异。 3.观察最早到达尸体的双翅目种类及嗜尸性昆虫的演替规律。 方法: 1.连续2年(2011/2012)的冬夏季节用动物尸体进行实验。 2.在每次观察中，检查尸体的腐败阶段，采集不同发育阶段的有代表性的样本（死的和活着的样本），并记录温度和相对湿度等环境变量。 3.请分类专家依据本地物种的形态学特征对物种行形态学鉴定。 结果： 1.夏季在动物尸体上取得了3目7科10种的物种，而冬季在动物尸体上获得了4目8科12种的物种。虽然在冬季可以收集到更丰富的样本物种，但在夏季每个物种的样本数量更多。 2.一般情况下，蝇科和厕蝇科在夏季研究中占主导地位而麻蝇科在冬季占主导地位。 3.冬季动物尸体的分解的速度明显慢于在夏季的速度。 4.相比夏季，在冬季双翅目到达尸体明显延迟。夏季最先到达尸体的类群是家蝇，而在冬季最先到达的白头裸金蝇。 5.通过分析所收集到的样本，构建了夏季和冬季的物种的共生矩阵表。 结论： 本研究结果提示开展地域性昆虫演替规律调查研究是十分重要的，在不同的区域范围内确定最有可能出现的昆虫种类对于法医学案例也至关重要。演替实验也是评估分子标记鉴定能力的一个基本步骤。 二、细胞色素氧化酶基因Ⅰ(COI):利用短片段和长片断鉴定嗜尸性双翅目昆虫 背景： 在法医学领域，正确的鉴定是一个关键性的问题，因为有缺陷的法医学证据可能导致审判不公。在以被准确评估后的遗传标记为指导的鉴定工具包中，以分子为基础的方法被认为是一个重要工具。本文第一次使用线粒体细胞色素氧化酶基因Ⅰ(COI)的272-bp和1173-bp两个片断对来自埃及的嗜尸性昆虫进行评估。并且，由于现有中国的相关数据全部来自对短片段的研究，本文也第一次使用COI的长片断对中国的嗜尸性昆虫进行评估。因此，这些研究对于确定以上片断的适用性是非常有意义的。从两个地区收集到的样本对于使用这些分子标记鉴定物种和种群具有重要意义。 目的： 确定COI长、短两个片断对于鉴定嗜尸性双翅目昆虫的鉴别效力，并且通过以下三个方面评估和比较这两个片断: 1、种内及种间差异 2、所研究物种的单系分离 3、通过邻接法建立于与分类学一致的系统发育树确定这些片断在种群水平上鉴定同种的鉴别效力。 方法： 1、形态学鉴定来自18个物种的50个样本。 2、DNA提取。 3、使用两个片断的引物进行PCR扩增，之后产物直接用于测序。 4、使用Kimura双参数距离模型(K2P)对核苷酸序列的分歧进行计算，通过邻接法(NJ)建立系统发育树。 结果： 1、在种内和种间差异中两个片断显示了类似的结果。 2、长片断能够以高的自举值完整地区分单系物种，明显优于短片段。 3、使用长片断对这些物种建立的NJ系统发育树与分类学结果较为一致，远远优于短片段。 结论： 1、COI长片段的鉴定结果更为可靠和安全，因为它能够优化分歧，特别是对那些具有低水平分歧的物种。 2、长片断另外一个优点是除了能够得到与形态学分类相一致的结果之外，还特别适用于鉴定已建立本地数据库中的新物种。 3、在种群水平上COI基因不能区分同种昆虫。 三、细胞色素氧化酶基因Ⅱ:利用短片段鉴定嗜尸性双翅目昆虫 背景： 由于相对较高的变异度，细胞色素氧化酶基因Ⅱ可以成功用于进化学研究、群体遗传学和分类学。然而，仅有少数文献报道使用该基因进行嗜尸性蝇类鉴定。在将任何遗传学标记用于实际案例之前，需要对这些标记进行评估。为了作为可用的法医学工具，这些标记必须含有有效的变异区能在种及种群水平上产生唯一的标识。由于短片段具有简单、低成本和很好的应用前景，最近有文献报道使用一个189-bp COII片段鉴定来自中国的3种麻蝇。目前，在埃及没有使用该片断发表的数据。因此，本研究利用该片断鉴定来自两个不同地区的三科昆虫（家蝇科、麻蝇科和蝇科）14种蝇类，进而评估该片断的实用性。 目的： 通过以下方法评估长度小于200-bp小片段的使用性: 1、测量种内及种间差异。 2、在科水平上证实所研究物种的单系分离及正确归类。 方法： 1、形态学鉴定来自14个物种的53个样本。 2、DNA提取。 3、使用该片断的引物进行PCR扩增，之后产物直接用于测序。 4、使用Kimura双参数距离模型（K2P）对核苷酸序列的分歧进行计算，通过邻接法(NJ)建立系统发育树。 结果： 1、同种蝇类无种内差异，种间差异为2％～25％。 2、除了H.melanura和秋家蝇M.autumnalis，所有样品都正确的归类。 结论： 尽管分子生物学对于鉴定嗜尸性昆虫是一种有效的方法，然而我们建议小于小于200-bp小片段用于鉴定仅仅是对传统方法的补充。 四、章基于COI和COII基因利用PCR-RFLP技术鉴定嗜尸性麻蝇 背景： 利用麻蝇进行死亡时间推断是十分有限的，因为麻蝇的形态学鉴定十分困难，无论是在幼虫、蛹还是成虫阶段，它们都具有相似的特征。几乎所有可用的PCR-RFLP数据都来自丽蝇科昆虫。并且，对使用PCR-RFLP技术进行物种鉴定仍存在争议。目前，尚无来自中国或埃及有关被检验的物种和分子标记的数据。 目的： 1、评估部分COI-COII基因的使用性;基于直接测序鉴定四种常见的嗜尸性麻蝇。 2、评估该PCR-RFLP技术的实用性;基于COI-COII片断，PCR-RFLP作为一种简单、快速和低成本的技术鉴定四种常见的嗜尸性麻蝇。 方法： 1、形态学鉴定4个麻蝇物种。 2、DNA提取。 3、使用该片断的引物进行PCR扩增，之后产物直接用于测序。 4、使用限制性内切酶HinfI和MfeI对PCR产物进行酶切，使用电泳确定条带图谱。 5、使用Kimura双参数距离模型(K2P)对核苷酸序列的分歧进行计算，通过邻接法(NJ)建立系统发育树。 结果 1、所有被检测样品都正确的归类。 2、联合使用限制性内切酶HinfI和MfeI产生了不同的限制性片断长度多态性(RFLP)图谱，并且对3种同地区的麻蝇同样有效。 结论： 本研究证实了基于部分COI-COII基因的PCR-RFLP技术可以正确的鉴定嗜尸性麻蝇。
线粒体DNA;细胞色素氧化酶基因;麻蝇科;嗜尸性昆虫;法医学鉴定
中南大学
博士
基础医学
文继舫;蔡继峰
2013
中文
R384.2;D919.4
145
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）