ADAM23基因对肺腺癌细胞SPC-A-1浸润和转移的影响及其机制的研究
背景:肺癌是最常见的恶性肿瘤之一。浸润和转移是肺癌病人死亡的主要因素。因此深入探讨肺癌浸润和转移的机制，寻找肺癌浸润和转移相关的分子，对肺癌的临床治疗和预后具有重要的意义。 去整合素-金属蛋白酶23(ADAM23，A Disintegrin AndMetalloprotease23)基因属于ADAM家族，是锌蛋白酶总属的一种跨膜糖蛋白，介导细胞-细胞及细胞-基质间的黏附融合。近来研究发现ADAM23作为一种抑癌基因，其表达缺失与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。本课题组前期实验发现在非小细胞肺癌中，ADAM23由于启动子区甲基化而呈低表达，且与肺癌的浸润转移负相关;ADAM23可通过负调控αvβ3而介导肺癌的浸润转移。ADAM23在肺癌浸润转移中具有重要作用，但其具体机制尚不明确。 上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition， EMT)是指上皮性细胞在特定的生理和病理情况下向间充质细胞转分化的现象。研究表明EMT在恶性肿瘤的浸润转移过程中发挥着关键作用，与肿瘤临床分期密切相关。但在肺癌浸润转移过程中ADAM23与EMT关系尚未见文献报道。 人类fascin1基因属于fascin家族，其蛋白质编码产物是分子量为55KD，能与F-肌动蛋白结合的细胞骨架蛋白，定位于细胞质张力纤维中，与细胞膜皱褶边缘的丝状伪足及微棘的形成有关，这些结构与肿瘤细胞的浸润转移密切相关。研究表明fascin1参与了肝癌EMT的形成;在多数肿瘤组织中表达上调，并且与肿瘤的区域淋巴结转移、远处转移、复发及病人的预后密切相关。近来有研究报道fascin1在肺癌浸润转移中起重要作用。 microRNA（miRNA）是一类长约19～25个核苷酸的非蛋白编码的单链RNA分子，能在转录后水平抑制靶基因的表达或翻译，与个体发育、增殖、分化以及恶性肿瘤发生密切相关。研究表明miRNA可作为癌基因或抑癌基因参与肿瘤的发生发展过程，在肿瘤的浸润转移过程中发挥着重要作用。 本实验旨在研究ADAM23基因对肺腺癌细胞SPC-A-1浸润和转移特性的影响，检测稳定抑制ADAM23表达的肺腺癌细胞中miRNA差异表达谱的变化，探讨ADAM23在肺癌浸润转移过程中的作用和机制，及其与EMT和促肿瘤浸润和转移分子fascin1的相互关系，以及ADAM23可直接调控的miRNA，为深入探讨肺癌浸润转移的机制，并为以ADAM23作为靶点的肺癌基因治疗提供理论基础和实验依据。 方法: (1)利用脂质体介导的转染技术，分别瞬时转染干扰质粒ADAM23-shRNA-1、ADAM23-shRNA-2、ADAM23-shRNA-3和空白质粒(pYr-3.1-CON)到SPC-A-1细胞，以空白质粒转染组为阴性对照，以空白转染组（本底细胞）为空白对照;分别采用real time PCR和western blot检测3个干扰质粒，筛选出抑制效率最佳的干扰质粒; (2)利用脂质体介导的转染技术，分别转染质粒ADAM23-shRNA-3、pYr-3.1-CON到SPC-A-1细胞，经G418筛选得到稳定抑制ADAM23表达的肺腺癌阳性克隆细胞（shADAM23）;分别采用real time PCR和western blot检测shADAM23细胞、pYr-3.1-CON细胞及未转染组(NT)三组细胞中ADAM23 mRNA及蛋白的表达; (3)采用westernblot检测shADAM23细胞中TWIST、E-cadherin、vimentin、α-SMA的蛋白表达; (4)采用real time PCR和westem blot检测shADAM23细胞中fascin1 mRNA和蛋白表达水平，并分析ADAM23与fascin1的相关性; (5)用Transwell侵袭实验、Transwell迁移实验检测shADAM23细胞侵袭迁移能力的变化; (6)用miRNA芯片检测shADAM23中miRNA表达谱的变化。 结果: (1) ADAM23-shRNA-3可有效抑制SPC-A-1中ADAM23mRNA和蛋白的表达; (2)经G418筛选，real time PCR及western blot鉴定，成功建立了稳定抑制ADAM23表达的肺腺癌阳性克隆细胞（shADAM23）; (3)与CON和NT比较，shADAM23细胞中E-cadherin表达降低，TWIST、vimentin、α-SMA表达升高; (4)与CON和NT比较，shADAM23细胞中fascin1 mRNA和蛋白表达升高; (5)与CON和NT比较，shADAM23细胞迁移和侵袭能力明显增强(P＜0.05); (6)与CON比较，芯片结果显示shADAM23细胞中34个miRNA表达上调，36个miRNA表达下调。 结论: (1) ADAM23基因低表达能增强肺腺癌细胞的浸润转移能力; (2) ADAM23基因低表达可通过上调TWIST,诱导EMT的发生促进肺腺癌的浸润转移; (3) ADAM23基因介导肺腺癌的浸润转移可能与fascin1相关; (4)芯片结果显示稳定抑制ADAM23表达的肺腺癌细胞中34个miRNA表达上调，36个miRNA表达下调。
肺癌;金属蛋白酶23基因;跨膜糖蛋白;细胞浸润;肿瘤转移;RNA干扰
中南大学
硕士
基础医学
周建华
2013
中文
R734.2;R73-37
77
2013-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）