胎儿附属组织来源干/祖细胞的实验研究
近年来，国内外已经认识到成体干细胞可以作为细胞治疗或基因治疗的种子细胞，但仍然存在像异体移植免疫排斥、来源困难、体外扩增不易控制等成体干细胞应用的主要障碍。分离扩增成体干细胞以提供充足的移植细胞，是应用的关键。胎儿附属物是胎儿出生时除胎儿以外的其他组织，包括胎盘、脐带、脐血、胎膜、羊水等。以往的处理是在胎儿出生后将这些附带组织废弃。随着近年来干细胞技术的发展逐渐认识到，在胎儿附属物中包含了大量具有干细胞特性的细胞。由于取材方便且无创伤、没有伦理问题、可以在长期保存后作为自体治疗的良好材料等诸多优势，从胎儿附属物中分离成体干细胞逐渐成为新的研究热点。如果能够建立从胎儿附属物中分离纯化扩增成体干细胞的技术，将为临床疾病的细胞治疗和基因治疗提供新的具有广阔前景的种子细胞来源，同时也为探讨胚胎发生、组织细胞分化等发育生物学问题提供细胞模型。我们的研究就是围绕上述问题展开，选择脐血、胎膜、胎盘为研究材料，分离培养扩增具有干细胞特性的细胞，研究其生物学特性、安全性及低温生物学、基因转染等与临床应用密切联系的问题，为今后的自体化细胞治疗和基因治疗提供可靠的实验基础。
本文首先从胎儿附属组织中分离各种具有干细胞特性的细胞，如脐血来源内皮祖细胞、胎膜组织贴壁细胞、脐带血管周细胞，优化并稳定培养条件；通过生长曲线、流式细胞技术、免疫细胞化学、集落培养、细胞功能测定、诱导分化等实验鉴定所分离细胞的生物学特性；其次，通过低温冻存前后比较，观察低温长期保存对上述细胞的影响；此外，通过核型分析和体内体外致瘤性实验对胎儿附属组织分离干细胞的安全性进行评价；最后，利用上述鉴定并评价的干细胞作为基因治疗的靶细胞，尝试不同的体外转染方法如脂转、电转，以夏家辉院士发明的“人源基因载体”介导标记基因来探讨胎儿附属组织来源干细胞作为基因治疗靶细胞的实验方法。
结果发现：(1)脐血来源的内皮祖细胞：可在体外进行长期传代培养，群体倍增水平可达42代，表达内皮细胞表面抗原，具有内吞ac．LDL，结合UEA-1的内皮细胞特性及体外成血管的能力，分离培养的不同代次的内皮细胞均具有正常核型，未见致瘤性。(2)胎膜组织贴壁细胞：具有良好的增殖能力，表达CD44、CD29，不表达CD34、CDI4、CD45，经诱导后能够分化为成骨细胞和成脂细胞，传代多次后核型正常，未见致瘤性。(3)脐带血管周细胞：具有间质细胞的表型特征，如表达CD29、CD44等表面标志物。并且通过CFU-F形成实验证实，所培养的脐带来源贴壁培养细胞具有自我增殖能力，推测它们具有干／祖细胞特性。(4)冻存前后上述细胞冻存生物学特性未见明显差别，并且冻存的胎盘组织中也可以分离得到胎盘来源贴壁细胞，表型与新鲜组织分离细胞无差别。(5)通过脂转或电转方法可以介导人源基因载体携带外源标记基因在上述细胞得到表达。结果表明：(1)胎儿附属组织中可以分离得到大量具有干／祖细胞特性的细胞群体，如脐血来源的内皮祖细胞、胎膜组织贴壁细胞、脐带血管周细胞；(2)上述细胞具有较高的增殖潜能，在体外传代可以大量扩增，长期传代具有一定安全性。(3)胎儿附属组织中的干／祖细胞或胎盘组织可以通过冻存方法保存备用，以形成自体干细胞库。(4)上述细胞可以作为基因治疗和细胞治疗的种子细胞。
脐血来源;内皮祖细胞;人源基因载体;胎儿附属组织;成体干细胞;生物学特性;增殖潜能;基因治疗;细胞治疗
中南大学
硕士
遗传学
梁德生;邬玲仟
2006
中文
R329.28
67
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）