钩端螺旋体表达谱的研究及噬菌体片段转录调控表达研究
钩端螺旋体简称钩体，属于螺旋体目(Spirochaetals)螺旋体科(Spirochaetaleae)钩端螺旋体属。其中致病性钩体引起钩体病(Leptospirosis)，此病人兽共患并呈全球分布。人通过直接或间接接触感染动物的尿液而感染。钩体病(Leptospirosis)l的临床特点为高热、头痛、寒战、乏力、淋巴结肿大和明显的肌肉疼痛。重者可并发肺出血、黄疸、脑膜脑炎和肾功能衰竭等。由于缺乏有效的遗传工具，对钩端螺旋体的研究，尤其对其致病机制的研究还相对较困难，因此对其致病机理的研究还不是很深入。
钩端螺旋体的全基因组测序工作已于2002年完成，本实验室于2004年根据注释的ORFs设计了钩端螺旋体的cDNA芯片。依据ORF注释，对碱基序列>150bp的ORF设计特异引物，共设计3582个ORF，并以此PCR产物构建芯片，每个点重复三次。钩端螺旋体共注释了4528个ORF，此基因芯片包含了全部注释基因的79.1％。本试验利用钩端螺旋体的cDNA芯片，分别研究了毒力株和减毒株，以及不同传代的毒力株表达谱的差异。
钩端螺旋体黄胆出血群赖型赖株毒力株[＃]56601(中赖)与钩端螺旋体黄胆出血群赖型赖株减毒株(法赖)在遗传背景上具有很大的相似性，但毒力却有很大的差别。本试验以37℃为试验的培养条件，以体外37℃培养的钩端螺旋体黄胆出血群赖型赖株毒力株[＃]56601(中赖)为测试株(tester)，以钩端螺旋体黄胆出血群赖型赖株减毒株(法赖)为对照株(refenence)，利用钩端螺旋体的cDNA芯片测试了不同毒力株芯片表达谱的差异。结果表明在37℃培养条件下，毒力株和减毒株的表达谱具有明显的差别。37℃培养时，毒力株中赖上调表达的基因有101个，下调表达的有71个。这些差异表达的基因在功能上可以分i0类。参照NCBI COGs功能分类，在上调表达的基因中，溶血素基因2个，脂蛋白基因2个，复制、转录及翻译相关基因11个，防御机制相关基因2个，信号转导及调控基因8个，膜蛋白基因及膜蛋白发生基因11个，细胞动力基因5个，分泌基因2个，蛋白翻译后修饰及折叠基因7个，新陈代谢相关基因29个，其它为功能未知蛋白基因。在下调表达的基因中，转运及结合蛋白2个，复制、转录及翻译相关基因21个，防御机制相关基因2个，信号转导及调控基因6个，膜蛋白基因及膜蛋白发生基因4个，细胞动力基因1个，分泌基因2个，蛋白翻译后修饰及折叠基因1个，新陈代谢相关基因16个，其它为功能未知蛋白基因。这些差异表达的基因可能在钩端螺旋体毒力株致病方面发挥一定的作用。
致病性钩端螺旋体又可分为毒力株和减毒株。减毒株是由于钩端螺旋体在体外传代超过200次而导致的毒力大大减弱而造成的。很多研究认为钩端螺旋体在体外传代超过10次就会造成毒力的减弱，在传代20次后钩端螺旋体的形态就发生了较为明显的变化，其一些生理学性质也发生了明显的改变。
为了能够在全基因组水平上研究体外培养过程中引起钩端螺旋体发生变化的分子机制，本试验利用钩端螺旋体的aDNA芯片研究了钩端螺旋体在体外培养第一代与第五代、第十代及第二十代表达谱的差异。从芯片的结果来看，中赖第一代和第五代及第一代和第十代相比差异表达基因分别为57个和80个，而第一代和第二十代相比差异表达的基因为270个。这一结果证实了钩端螺旋体在体外传代少于10次时，钩端螺旋体未发生很明显的毒力及其它方面的改变。而当体外传代多于二十次后，钩端螺旋体体内发生了较为明显的变化。变化较为明显基因包括细胞膜及膜生成相关基因，信号转导相关基因及细胞动力相关基因，这些发生明显改变的基因可能与以前试验所报道的细胞膜分子的变化及细胞形态的变化及细胞的致病力有关。同时新陈代谢相关基因也发生了较为复杂的变化，这可能是钩端螺旋体适应体外环境的结果。
同时在本试验中第一代和第二十代的芯片结果中还有两段共调控的基因，这一共调控的基因片段的功能还不是很清楚。在第三章我们将进一步研究其功能及其调控。
在很多细菌基因组中，都有噬菌体基因或者是噬菌体片断的存在。噬菌体DNA作为重要的基因水平转移载体，在致病菌的毒力进化过程中起着重要的作用。噬菌体作为细菌的一个独立存在的遗传单位，既可以独立于细菌染色体之外也可以整合于细菌染色体之上，所以成为研究细菌基因组学的一个重要遗传工具。到目前为止，致病性钩端螺旋体中一直没有分离到噬菌体颗粒存在。本试验首先用生物信息学方法，利用已知的噬菌体序列对LA01 83一LA0221片段做了BLAST分析(www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST／)和蛋白保守区的分析(http：//pfam.wustl.edu/hmmsearch.shtml)。分析表明在这一片段上，存在有较多的噬菌体同源序列，它们分别与整合酶基因、一噬菌体调控基因及噬菌体结构蛋白具有相似性。其中LA0195蛋白具有明显的噬菌体调控蛋白CI蛋白保守域及DNA结合域。LA0184与整合酶有较低的相似性，LA0189与Mu噬菌体的gam蛋白有较高的相似性，LA0205、LA0211及LA0215均为类噬菌体结构基因。本试验从操纵子结构、启动子序列、及cI基因的功能对此片段做了研究。
运用RT-PCR技术，在相邻的基因之间跨相邻基因设计PCR引物，共设计了覆盖LA0183-LA0219的20对引物，做RT-PCR研究此片段的基因共转录。结果表明，此片段共包含5个转录子，从左到右依次为：LA0183-LA0185为正向共转录、LA0186-LA0194为反向共转录、LA0196-LA0197为反向共转录、LA0198-LA0202为正向共转录、LA0203-LA0219，为正向共转录。
由于LA0195为C／的同源蛋白。在多数噬菌体中，CI蛋白主要结合在邻近的特异DNA序列上以调控噬菌体基因表达。因此，我们首先对LA0195邻近的序列做了生物信息学分析。第果表明，在LA0194基因与LA0195基因的基因间序列存在有一正向重复序列和一反向重复序列。由于启动子序列上也有特异的DNA—binding域，我们运用http：//www.soflberry.com／berrv.phtml．软件，对邻近LA0195蛋白的LA0195、LA0194及LA0198基因的启动子序列进行了预测并把预测的序列克隆到启动子载体pKK232-8中以进一步证实启动子的活性。通过氯霉素筛选及CAT-ELLISA试验，LA0195及LA0194启动子在大肠杆菌中具有很强的启动活性，而LA0198的启动子没有很明显的启动活性。
LA0194及LA0195启动子均包含了LA0195与LA0194之间的重复序列。为了证明LA0195蛋白是否具有结合以上调控序列的功能，我们在体内对LA0195蛋白进行了克隆表达和纯化。为了测定LA0195蛋白的结合能力，我们对LA0194、LA0195及LA0198的启动子序列进行了生物素标记，用pierce公司的EMSA试剂盒在体外做了LA0195蛋白与启动子的体外结合试验，结果表明，LA0195蛋白与LA0194启动子及LA0195启动子均有结合活性。这说明LA0195蛋白在体内还应具有一定的调控能力。
本试验首次对钩端螺旋体的类噬菌体序列做了研究。一般来讲，噬菌体序列对宿主都有一定的贡献，如在致病性及抗药性方面起一定的作用。如果一段噬菌体序列对宿主没有任何贡献，在长期的进化过程中会逐渐被淘汰。此噬菌体片段所具有的作用目前还不是很清楚，但此噬菌体包含有孔一孔形成蛋白(LA0202)及裂解域蛋白，这些蛋白的功能还有待于进一步的研究。
钩端螺旋体;基因芯片;基因表达谱;噬菌体;基因转录
四川大学
博士
遗传学
刘世贵;郭晓奎
2006
中文
Q939.2;Q344.13
128
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）