粘质沙雷氏菌杀虫蛋白的分离纯化及其基因的克隆与表达研究
蝗虫是一种主要的草地害虫，对我国农牧业的造成了极大的损失，我国目前控制蝗虫危害的手段主要是采用化学药剂来降低虫口密度，但是过度的使用化学农药对环境造成了相当的危害，迫切需要采用一些生物防治手段来作为替代。因此，蝗虫的生物防治技术应运而生，并日益受到重视。
本实验从蝗虫自然病死虫户中分离纯化得到一较高毒性的病原菌HR一3，通过形态学观察、生理生化特征分析和分子鉴定将其鉴定为为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，为细菌杀虫剂的研究开发提供了新的菌株来源。微生物杀虫剂由于所使用的病原微生物不同，其杀虫原理和机制有所不同，粘质沙雷氏菌HR-3的杀虫活性实验表明，其杀虫活性物质是存在于细菌上清液中的杀虫蛋白。将细菌发酵上清液进行Milipore超滤，除去40kDa以下和80kDa以上的蛋白，获得40-80kDa的杀虫粗蛋白。进一步经过硫酸铵分级沉淀，DEAE—Sepharose Fast Flow离子交换层析，Sephacryl S-200凝胶过滤，获得电泳纯的杀虫蛋白。每升发酵液中可获得约10ml杀虫蛋白溶液，冻干可获得4.5mg活性蛋白，SDS-PAGE电泳和凝胶过滤实验表明该杀虫蛋白为单体，分子量约为60kDa。
粘质沙雷氏菌分泌的许多著名的胞外蛋白，分别为核酸酶、磷脂酶、溶血素、含铁细胞、几丁质酶、含铁细胞、蛋白酶、脂肪酶，其中的一种或几种蛋白有可能是杀虫活力因子。通过酶活检测结果表明，纯化的杀虫蛋白仅具备蛋白酶活性，杀虫蛋白应是一种蛋白酶。用EDTA和1-10-phenanthrolin可以抑制杀虫蛋白的杀虫活性和蛋白酶活性，而PMSF没有影响，表明杀虫蛋白是一种金属蛋白酶。同时，测定纯化的杀虫蛋白N-端18个氨基酸序列为Met Gln Ser Thr LysLvs Ala Ileu Glu Ileu Thr Glu Ser Glu Leu Ala Ala Ala，与来源于粘质沙雷氏菌SM6和沙雷氏菌E15的金属蛋白酶N-端18个氨基酸序列具有很强的相似性，进一步证明该杀虫蛋白是金属蛋白酶。
杀虫蛋白对蝗虫的毒力研究结果显示，其毒力回归方程为v=1.0907+0.5960x，致死中浓度LC<,50>=1.0907(0.7348—1.4465)μg，实验结果也说明了纯化的杀虫蛋白的量增加，即金属蛋白酶酶液浓度增高，杀虫活性越强。
粘质沙雷氏菌HR-3发酵上清液加入10 mmol／L的EDTA和10 mmol／L1-10-phenanthrolin后，没有检测到蛋白酶活性，说明发酵上清液中只含有一种蛋白酶，即金属蛋白酶，且己知金属蛋白酶酶液浓度越高，杀虫活性越强，因此可以用粘质沙雷氏菌HR-3的蛋白酶活力，加上菌体生长量来作为参照标准来进行粘质沙雷氏菌HR-3发酵条件优化和进行菌种选育。
研究起始pH、培养温度、时间、接种量、培养基装量以及碳氮源对HR-3菌体生长量和蛋白酶酶活的影响，通过正交试验得到HR-3的最优发酵培养基组成为：大豆蛋白胨2％，蔗糖2％，NaCl O.5％，pH值为7.5。同时，用CO<,2>激光辐照诱变菌株获得高产杀虫蛋白的菌株，经过CO<,2>激光辐射诱变(激光功率10W，扩束光斑直径0.5cm，照射距离23cm，照射时间30 s)，选育出高产金属蛋白酶的菌株粘质沙雷氏菌HR-10，经过传代培养，发现具有稳定的高产金属蛋白酶活力。
本实验在已证明杀虫蛋白是金属蛋白酶的基础上，进一步研究了纯化的杀虫蛋白作为金属蛋白酶的一些酶学性质。动力学方法测得该酶的最适pH值7.5，最适温度为40℃，对热较为稳定。Zn<'2+>、Cu<'2+>离子对酶活有不同程度的抑制作用；Mn<'2+>、Ca<'2+>、Mg<'2>离子对酶活有不同程度的激活作用。WRK，AcBr的修饰能显著的抑制杀虫蛋白的蛋白酶活力，活力的降低与修饰剂的浓度呈正相关；NBS，TNBS，DTT的修饰对杀虫蛋白的蛋白酶活力没有明显的影响。结果说明His和Glu(或Asp)可能是杀虫蛋白的蛋白酶活力的必须基团。
根据杀虫蛋白的N-端测序结果和同源性分析设计了一对引物，采用PCR技术扩增出杀虫蛋白成熟肽编码区序列。测序结果显示，该片段长1464bp，编码487个氨基酸残基，是一个完整的编码区序列。该基因序列与报道的粘质沙雷氏菌SM6菌株的金属蛋白酶基因的同源性达到98％，推导的成熟肽氨基酸序列与粘质沙雷氏菌SM6菌株金属蛋白酶成熟肽同源性达到99％。
将含有杀虫蛋白成熟肽编码区的重组质粒pETHR-3A和pET HR-3B，转化Esehefiehia coli BL21(DE3)分别进行融合与非融合表达。SDS-PAGE显示出与预期结果一致的活性带；两者的表达量都分别达菌体可溶性蛋白的30％和15％左右。融合表达蛋白完全以包涵体的形式存在；而非融合表达蛋白一部分以可溶蛋白形式存在，一部分以包涵体形式存在的，并且在细菌破碎上清液中检测到了金属蛋白酶，说明杀虫蛋白(金属蛋白酶)得到了表达。
粘质沙雷氏菌;菌种筛选;杀虫蛋白;金属蛋白酶;分离纯化;CO2激光辐照选育;基因克隆;基因表达
四川大学
博士
遗传学
刘世贵
2006
中文
Q949.31;Q785
122
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）