大蓟抗肿瘤成分的筛选及其用机制的研究
大蓟为菊科管状花亚科菜蓟族蓟属植物Cirsium faponicum DC．的干燥地上部分或根，多年生草本，高100—150cm，茎直立，密被白毛，叶互生；叶片倒卵状长椭圆形，边缘具浅裂和斜刺，被毛；5—6月开花，头状花序顶生，花单生，紫红色，瘦果扁椭圆形，生于山野路边，以全草和根入药，我国大部分地区有分布。全草灰绿色，大蓟性凉，味甘、苦、归心、肝经，功效为凉血止血、祛瘀痛，主治吐血、衄血、尿血、血淋、血崩、带下、肠风、肠痈、痈疡肿毒、疔疮、高血压及肝炎等。其化学成分复杂，主要含有黄酮、黄酮苷，挥发油、三萜和甾醇等物质。大蓟在民间验方多用于治疗癌症，如：大蓟根、三白草根治肝癌；鲜大蓟叶与鸡蛋清搅拌后贴于患处，可治乳腺癌等。赵鹏等用大蓟提取物对Hep细胞毒性的研究表明：大蓟提取物能抑制Hep细胞的生长，并能提高Hep荷瘤小鼠的免疫功能等。但对其抗肿瘤成分及其抗肿瘤机制未见报道。
本论文以大蓟为研究材料，应用药物化学、分析化学、生物技术、药理学、细胞学、分子生物学等方法，通过有机溶剂提取、硅胶层析和凝胶层析，以H22和S180为肿瘤模型筛选大蓟的抗肿瘤活性成分，并从免疫和诱导调亡方面探明其抗肿瘤机制，为抗肿瘤新药的开发及大蓟的利用提供科学依据和理论基础。
以H22和S180为肿瘤模型，用大蓟水提物、醇提物和乙酸乙脂萃取物等抑制肿瘤的生长，乙酸乙脂萃取物的抑制作用最明显，其抑瘤率为40.42％。紫外图谱和特征显色鉴别出大蓟中抗肿瘤的活性成分主要为黄酮类成分，以芦丁为对照品，用紫外分光光度计测定其总黄酮的含量为65.89％。
用硅胶柱分离大蓟中的黄酮类成分，得到两个黄酮单体，并用紫外、红外、质谱等光谱分析，确定两个黄酮单体分别为柳穿鱼叶苷和5，7二羟基．6，4-二甲氧基黄酮，再以S180为肿瘤模型比较大蓟总黄酮及两个单体化合物的抗肿瘤作用，结果表明大蓟的两种黄酮混合物抗肿瘤作用强于两个单体化合物。
为探明大蓟总黄酮的抗肿瘤作用与机体免疫的关系，以H22和S180为肿瘤模型，研究大蓟总黄酮对肿瘤小鼠的免疫器官指数、溶血素、脾细胞转化率及NK细胞活性等方面的影响，结果表明大蓟总黄酮和两个黄酮单体均能提高免疫功能的胸腺指数、脾指数和溶血素水平，促进脾细胞转化率及增强NK细胞活性。但大蓟总黄酮的作用强于两个单体化合物，尤其以50mg／ml为最佳，与模型组比较差异极显著(*P<0.01)。表明大蓟总黄酮的抗肿瘤作用是通过提高机体的免疫功能来实现的，并且总黄酮作用强于单个化合物，两个单体化合物在机体中的抗肿瘤作用是相互促进的。
以人肝癌SMMC-7721细胞和人子宫癌Hela细胞为模型，通过MTT法、琼脂糖凝胶电泳和DAPI染色对大蓟总黄酮诱导癌细胞的凋亡进行研究，结果表明：大蓟总黄酮对SMMC-7721和Hela的IC50分别为93.64μg／ml和85.12μg/ml：琼脂糖凝胶电泳表明，实验组细胞可见清晰的DNA“梯子”(Ladder)，呈剂量依赖性，而空白组细胞不见DNA“梯子”。DAPI染色后在电镜下观察发现，实验组癌细胞有明显的凋亡小体，故认为大蓟总黄酮可能是通过诱导肿瘤细胞调亡来实现抗肿瘤作用的。
以研究大蓟总黄酮对肿瘤小鼠IL-1、IL-2和肿瘤坏死因子的影响，从分子水平上探明大蓟总黄酮抗肿瘤免疫的机理。通过提取给药组和空白组脾细胞和腹腔细胞的总RNA，采用具有高灵敏度的逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)技术从肿瘤小鼠脾细胞和腹腔细胞中检测细胞因子IL-l和IL-2的mRNA的表达。结果表明，大蓟总黄酮具有促进IL-1和IL-2mRNA表达的作用。
利用正交实验优化大蓟总黄酮的提取工艺，并用HPLC测定总黄酮中各黄酮的含量，其色谱条件为流动相A为PH=3.0的磷酸溶液：流动相B为甲醇。梯度洗脱，0～8 min 30％A～50％A：8～40 min 50％A。流速0.76mL／min，二极管阵列检测器检测。紫外检测波长280nm。并分别准确吸取柳穿鱼叶苷及5，7二羟基一6，4’一二甲氧基黄酮对照品溶液2、4、6、8、10和12μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图峰面积。以峰面积(A)对进样量(w)进行回归计算，分别得回归方程：A<,柳穿鱼叶苷>=8624.2w+7，r=0.9996：A<,5.7二羟基一6.4，一二甲氧基黄酮>=13807W-948.53，r=0.9994。实验结果表明；大蓟黄酮提取的最佳工艺为70％乙醇提取两次，第1次12倍量1h，第2次10倍量30min。
综上所述，大蓟的抗肿瘤活性成分主要为黄酮类物质，并且抗肿瘤活性是通过提高机体免疫功能和诱导癌细胞调亡来实现的。大蓟总黄酮的最佳提取条件为70％7,醇提取两次，第1次12倍量1h，第2次10倍量30min。
大蓟总黄酮抗肿瘤作用的质量标准为：紫外分光光度测定其总黄酮含量为98.52％，通过HPLC测定总黄酮中柳穿鱼叶苷和5,7二羟基—6,4＇—二甲氧基黄酮含量分别为55.23％和28.96％。
大蓟;正交试验;抗肿瘤机制;药理学;黄酮;免疫功能;动物模型
四川大学
博士
遗传学
杨志荣
2006
中文
R285.5;R979.1
123
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）