SARS病毒RdRp基因的RNA干扰研究
本研究选择SARS病毒的RdRp基因为RNAi的靶基因。我们首先设计了1种安全、高效而可靠的方法来合成该基因：根据DNA shuffling技术的原理和SARS病毒RdRp基因的序列，设计并合成了多条寡核苷酸片段，每个片段末端都两两互补，从而在PCR过程中相互延伸，最终精确地组装成RdRp基因。所得基因的序列与预期设计完全吻合。
利用pcDNA3.1(+)和pEGFP-C1载体构建了3类真核重组表达质粒，并以增强型绿色荧光蛋白作为标记基因。构建的表达质粒包括：1)分别表达RdRp和EGFP基因的质粒：pcDNA-RdRp和pcDNA-EGFP 。转染Vero E6细胞后，pcDNA-G可表达明显的绿色荧光蛋白；2)表达RdRp和EGFP融合基因的质粒：pcDNA-GR和pcDNA-RG，pEGFP-CRl和pEGFP-CR2。转染Vero E6细胞后，前2个质粒表达的蛋白质荧光较弱；后2个荧光很强，可用于瞬时表达研究；3)双顺反子表达质粒：以pcDNA3.1(+)为骨架，引入IRES元件，构建了pcDNA-GIR和pcDNA-RIG。pcDNA-GIR在细胞中的荧光蛋白表达量较强，还可以整合到宿主细胞的基因组中用于建立稳定的细胞株；pcDNA-RIG在细胞中的荧光蛋白表达非常弱。
对细胞转染条件进行了优化，结果发现：1)本研究中的最佳转染条件为：2μg超螺旋状态的无内毒素型超纯质粒DNA，DNA和转染试剂的比例为1:5，转染时细胞的汇合度为60-80％，DNA-转染试剂复合物与细胞共同孵育的时间为2-4 h；2)几种细胞的转染效率分别为：HEK293：85-90％；COS-7：75-80％；Hela：75-80％；Vero E6：10-15％；3)细胞株对G418的敏感性为：转染后最初的筛选，Vero E6、HEK293和COS-7使用800 mg/L的G418，Hela细胞为900 mg／L；对于筛选出来的稳定细胞株，Hela细胞用300 mg／L、其余3种用200 mg/L的G418来维持抗性。探索出通过手工分选来建立细胞株的方法，并分别建立了Vero-EGFP、Vero-RdRp、Vero-GIR和293-GIR等4种细胞株。Vero-RdRp能单独表达RdRp，可用于SARS病毒RdRp的真核细胞表达、纯化和性质等的研究；Vero-EGFP可以为RNAi研究或转染细胞时提供对照；Vero-GIR和293-GIR可用于研究siRNA对内源基因的干扰作用。
在上述所有结果的基础上，进行了RdRp基因的RNAi研究。1)用体外转录法合成siRNA，分别和质粒pEGFP-CRl共转染Vero E6细胞，利用荧光显微镜计数法、荧光定量RT-PCR和流式细胞术分别对实验进行分析，结果表明，各组siRNA的抑制效率分别为：siRl和siR2为85-90％，siR3和siR4为70-75％，sirl+siR2为95％，siGFP为80％，siNC为3％。2)用人U6启动子构建了siRl、siR2和siGFP的siRNA表达盒，将它们和pEGFP-CRl共转染HEK293细胞，48 h后的荧光显微镜观察和分析表明，SEC有着明显的抑制靶基因表达的作用，其效率和相应的siRNA一致。3)将siRl和siR2与pEGFP-CRl质粒以尾静脉高压注射法导入小鼠体内，用定量RT-PCR技术检测了48 h后几个重要器官中RdRp基因的表达，结果表明，siRNA在体内有着和细胞中相似的RNAi效果，而且同一种siRNA在不同的器官中作用效果一致。上述RNAi研究实验数据表明，对SARS病毒RdRp基因的2个位点进行干扰，可以获得80-90％的抑制效率；同时干扰这2个位点，其抑制效率可进一步增加，达到95％左右。
本研究首先通过3套方案的探索和改进，最终建立了1种优化的组装基因的方法，用合成的寡核苷酸片段在无病毒的体系中组装出完整的RdRp基因。随后，将组装的RdRp片段克隆到质粒pcDNA-3.1(+)中，获得真核表达质粒pcDNA-RdRp，再经测序证实，所获得的RdRp基因与预期设计完全吻合，并与99株SARS病毒基因组中的相应序列100％同源，表明该片段是最理想的RNAi靶序列。
本研究利用pcDNA3.1(+)和pEGFP-C1载体共构建了3类真核重组表达质粒：1、分别表达RdRp基因和增强型绿色荧光蛋白基因的质粒：pcDNA．RdRp和pcDNA-EGFP(pcDNA-G)。转染vero E6细胞后，经倒置荧光显微镜观察，pcDNA-G可表达非常明显的绿色荧光蛋白，pcDNA-R无荧光；2、表达RdRp和EGFP融合基因的质粒：pcDNA-GR和pcDNA-RG，pEGFP-CRI和pEGFP-CR2。转染Veto E6细胞后，前2个质粒表达的绿色荧光蛋白均较弱，后2个质粒在Vero E6细胞中表达的绿色荧光蛋白均很强，但它们无法整合到宿主细胞的基因组中，可用于瞬时表达的研究；3、双顺反子表达质粒：以pcDNA3.1(+)为骨架，引入质粒plRESneo中的IRES元件，构建了pcDNA-GIR和IpcDNA-RIG。其中pcDNA-GIR在细胞中的荧光蛋白表达量较强，载体也可以整合到宿主细胞的基因组中用于建立稳定的细胞株，而pcDNA-RIG在细胞中的荧光蛋白表达非常弱。
限制酶切和PCR鉴定以及测序分析均表明，上述各个质粒与预期结果相符；各质粒转染Vero E6细胞后，均能转录出预期大小的mRNA;经倒置荧光显微镜观察，各个质粒在Vero E6细胞中表达绿色荧光蛋白的强度由大到小为：pcDNA-G，pEGFP-CRI和pEGFP-CR2，pcDNA-GIR，pcDNA-GR，pcDNA-RG，pcDNA-RIG。后3个载体表达绿色荧光蛋白较弱，不宜于在后续研究中应用。pcDNA-R无荧光。pEGFP-CRI和pEGFP-CR2可用于瞬时转染，pcDNA-GR可用于稳定表达。
检测了几种常用细胞株对G418的敏感性，结果发现，转染后最初的筛选，对于Vero E6、293和COS-7这3种细胞，使用800 mg／L的G418进行，Hela细胞使用900mg／L的G418；对于筛选出来的稳定细胞株，Hela细胞用300 mg／L的G418、其余3种可用200 mg／L的G418来维持抗性。
建立了通过手工分选以建立细胞株的方法。该方法先离出单个靶细胞，由单细胞生长成1个克隆，再逐步扩大培养，直到获得细胞株。根据该方法，分别用质粒pcDNA-G、pcDNA-R和pcDNA-GIR转染Vero E6细胞，建立了Vero-EGFP、Vero-RdRp和Vero-GIR等3种细胞株；用质粒pcDNA-GIR转染HEK293细胞，建立了293-GIR细胞株。
利用体外转录系统合成了6条siRNA：4条针对SARS病毒RdRp基因，1条针对EGFP基因，1条和所有的EST序列都没有同源性的siNC，用作RNAi实验的负对照。这些siRNA为3’-端带-UU突起的2l ntdsRNA，是哺乳动物细胞中最有效的siRNA的结构形式。用Cy3标记siRNA并转染VeroE6细胞，发现其转染效率远远高于质粒，说明在进行siRNA和质粒共转染时，能导入质粒的细胞中基本都能同时导入siRNA，这为共转染siRNA和质粒以进行RNAi研究提供了一定参考。分别用这6条siRNA和融合表达质粒pEGFP-CRl共转染’Vero E6细胞，通过荧光显微镜计数法判断各RNAi组中EGFP表达受抑制的效率，随后又应用荧光定量RT-PCR和流式细胞术分别对实验进行分析，结果表明，3种方法可以取得比较一致的实验数据，各组siRNA的抑制效率分别为：siRl和siR2为85.90％，siR3和siR4为70-75％，siRl+SiR2为95％左右，siGFP为80％左右，siNC为3％左右。荧光显微镜计数法可以方便快捷、连续动态地对活细胞进i行观察分析，而且实验数据可靠，成为本研究中最主要的判断RNAi效果的方法。
siRNA表达盒是另一种可用于RNAi研究的分子，它在导入哺乳动物细胞后，能转录出小的发夹结构RNA，进而诱导启动RNm程序。本研究在上述实验结果的基础上，用人的u6启动子构建了RNAi效果最好的siR．1和siR2的SEC以及siGFP的SEC，在人胚胎肾上皮来源的HEK293细胞中，共转染SEC和pEGFP-CR．1，48 h后的荧光显微镜观察和分析表明，SEC有着明显的抑制靶基因表达的作用，其效率和相应的siRNlA一致。
应用尾静脉高压注射法将siRl和siR2与质粒pEGFP．CRl一起导入小鼠体内，用定量RT．-PCR技术检测了48 h后几个重要器官中RdRp基因的表达，结果表明，siRNA在体内有着和细胞中相似的RNAi效果，而且同一种siRNA在不同的器官中有着很一致的作用效果。
严重急性呼吸综合征;聚合酶基因;RNA干扰;绿色荧光蛋白基因;基因表达;冠状病毒;生物信息学;非典型肺炎
四川大学
博士
遗传学
张义正
2006
中文
R563.8
200
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）