鸡血藤促进造血功能的物质基础和机制研究
鸡血藤是传统中药中一味典型的活血化瘀药，主产于广东、广西、云南等省。鸡血藤性温，味苦、甘，归肝、肾经，具有补血、活血、通络之功效，在民间常用来治疗腰膝酸痛、麻木瘫痪、血虚萎黄及月经不调等疾病。现代药理研究表明：鸡血藤有抑制血小板聚集、降低血压、抗心律失常等作用。临床常用鸡血藤(单用或以鸡血藤为主组方)治疗各种原因(如放化疗、血液系统疾病)引起的白细胞、血小板及红细胞等全血象减少疾病。
关于鸡血藤的本草考证，过去研究较为混乱，鸡血藤的原植物分属于豆科和五味子科。直至1995年，《中华人民共和国药典》1995年版将鸡血藤定为显科植物密花豆Spatholobus suberectus Dun 的干燥藤茎，解决了其本草考证的争议。与本草考证类似，鸡血藤的化学成分研究也十分不足。资料表明，近年仅有少数研究对鸡血藤的化学成分进行了初步分析，但对其具体药效成分还不明确。虽然《中华人民共和国药典》2005年版中以芒柄花素作为鸡血藤鉴别的标准之一，但目前研究尚不能确定其即为鸡血藤促进造血功能的有效成分。由于有效成分的不明确，造成了目前研究对鸡血藤促进造血功能的作用机理的不明确。
针对以上现状，本论文首先系统研究了鸡血藤的促进造血功能的物质基础，通过有机溶剂提取、硅胶层析和凝胶层析，分离得到了鸡血藤的促进造血功能的有效成分，通过液质、红外光谱和核磁共振方法对鸡血藤的有效成分鉴定了结构鉴定。在以上研究的基础上，本论文进一步并对鸡血藤有效成分的促进造血功能作用机理，采用多种动物模型，在实验动物整体、细胞和分子水平上进行了详细的研究，基本明确了鸡血藤有效成分的作用机理。
本论文主要开展了以下的研究工作：
l、以乙酰苯肼联合环磷酰胺所致小鼠复合贫血模型为药效筛选平台，通过乙醇提取，有机溶剂萃取，索氏回流提取、硅胶层析和Sephadex LH-20凝胶层析方法对鸡血藤的有效成分进行了提取、分离和筛选。通过实验，最终确定了鸡血藤有效成分的提取工艺，并获得了鸡血藤促进造血功能的有效成分。
2、采用液质、红外光谱和核磁共振法对分离得到的有效成分进行了结构鉴定，并确定该成分为儿茶素(catechin)。
3、研究了儿茶素对模型小鼠外周血象的影响。实验结果表明，腹腔注射不同剂量的儿茶素能够对乙酰苯肼联合环磷酰胺所致小鼠复合贫血模型，环磷酰胺所致小鼠骨髓抑制模型和小鼠急性失血性贫血模型的外周血象有不同程度的恢复，其中腹腔注射儿茶素24mg／kg时效果最为明显，对乙酰苯肼联合环磷酰胺所致小鼠复合贫血模型的白细胞、红细胞和血红蛋白分别提高50.0％，26.O％和16.6％；对环磷酰胺所致小鼠骨髓抑制模型的白细胞、红细胞和血红蛋白分别提高42.5％，28.1％和12.2％；对小鼠急性失血性贫血模型的红细胞和血红蛋白分别提高19.4％和16.9％，给药组与模型组比较有显著性差异(P<0.05)。以上结果表明，儿茶素具有促进造血功能的作用，能够恢复多种模型小鼠的外周血象。
4、以MTT比色法检测骨髓细胞增殖能力，实验发现，腹腔注射儿茶素24mg／kg时，能有效促进正常小鼠的骨髓细胞增殖，提高达到了13.2％，差异极显著(P<0.01)；与乙酰苯肼联合环磷酰胺所致小鼠复合贫血模型相比，造模同时腹腔注射儿茶素24mg／kg组的小鼠骨髓细胞显著增多，提高达到了37.5％，呈极显著差异(P<0.01)。实验表明，儿茶素能够显著促进小鼠骨髓细胞的增殖能力。
5、通过脾结节生成实验，研究了儿茶素对骨髓造血干细胞增殖的影响，实验发现，与空白组相比，儿茶素能提高正常小鼠的骨髓细胞分裂能力，呈显著性差异(P<0.05)；与乙酰苯肼联合环磷酰胺所致小鼠复合贫血模型组比较，儿茶素能提高模型组小鼠的骨髓细胞分裂能力，差异极显著(P<0.01)。通过以上实验，表明儿茶素能够促进小鼠骨髓造血干细胞的分裂增殖能力，从而促进模型小鼠造血功能的恢复。
6、通过甲基纤维素半固体培养基集落形成实验对儿茶素促进CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CFU-Meg的生成能力进行了研究。实验结果显示，腹腔注射儿茶素24 mg／kg，与空白组相比，其CFU-GM有显著增加，有显著差异(P<0.05)，对CFU-E,BFU-E、CFU-Meg虽有一定促进作用，但未见显著性差异；与乙酰苯肼联合环磷酰胺所致小鼠复合贫血模型相比，腹腔注射儿茶素24 mg／kg组的CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CFU-Meg集落数均明显增加，呈极显著差异(P<0.01)。实验结果表明，儿茶素对造血祖细胞的生成能力有显著提高，是促进造血功能的主要原因之一。
7、以造血生长因子生物活性检测技术测定儿茶素促进小鼠细胞集落刺激因子(CSFs)分泌的影响，实验证明，经儿茶素体内诱导所制备的巨噬细胞、脾细胞、肺和骨骼肌体外条件培养液能明显促进正常小鼠和贫血小鼠骨髓细胞增殖(P<0.01)。
8、检测了正常和模型小鼠细胞分泌白介素1(IL-1)、白介素2(IL-2)、白介素3(IL-3)的影响，实验表明，儿茶素可显著提高正常和模型小鼠细胞IL-1、IL-2、IL-3的分泌能力。
9、观察了儿茶素对正常小鼠和模型小鼠脾细胞、腹腔巨噬细胞产生红细胞生成素的影响，实验发现，儿茶素模型组与模型组相比小鼠脾条件培养液中红细胞生成素的生成有极显著性差异，Epo生成量提高28.7％。儿茶素对正常小鼠腹腔巨噬细胞培养液中Epo生成有显著促进作用，与空白组相比提高了21.8％。
10、探讨了儿茶素对正常小鼠和模型小鼠的骨髓基质细胞分泌TNF的影响。实验发现儿茶素能抑制贫血模型小鼠的骨髓基质细胞分泌TNF。
以上7、8、9、10点的研究表明，儿茶素能够调节正常小鼠和模型小鼠体内造血相关细胞因子的分泌，其能够增加体内正向造血因子，如CSFs、IL-1、IL-2、IL-3、Epo等的分泌，同时抑制负向造血因子TNF的分泌，从而促进小鼠造血细胞的生存、增殖和分化，达到促进造血功能的功效。
11、利用<'60>Co γ射线一次性全身照射小鼠，动态观察其骨髓细胞、脾细胞凋亡情况。实验观察到照射后模型组小鼠骨髓细胞在6 h其凋亡数最多，以后随 时间延长而逐渐减少，儿茶素组小鼠骨髓细胞和脾细胞凋亡数与模型组相比两 者在6 h处有显著性差异(P<0.05，P<0.01)：在12，18，24 h也能相应的拮抗 细胞的凋亡。以上实验表明，儿茶素能够对抗辐射所致的骨髓细胞和脾细胞凋亡，对造血细胞有明显的保护作用。
12、利用基因芯片技术，检测了儿茶素对乙酰苯肼联合环磷酰胺所致小鼠复合贫血模型的基因表达谱的影响。通过提取模型给药组和模型组小鼠骨髓细胞RNA，进一步检测其中差异表达基因，结果显示，儿茶素在小鼠体内改变了多种其它基因的表达，为深入了解儿茶素的作用分子机制提供了详实全面的数据，有助于对儿茶素生物学活性的理解。
鸡血藤;骨髓细胞;造血功能;外周血象;细胞因子;细胞凋亡;动物模型
四川大学
博士
遗传学
杨志荣
2006
中文
R285.5
158
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）