根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的多年生黑麦草（Lolium perenne L.）遗传转化
多年生黑麦草是优良的牧草和草坪草，是畜牧业和草坪业重要的产业支柱。由于自交不亲和，传统遗传改良困难而复杂。生物技术尤其是转基因技术对其遗传改良带来希望。本研究通过根癌农杆菌介导，对多年生黑麦草进行遗传转化，成功地将外源报告基因或目的基因导入至多年生黑麦草中，获得转基因植株。
研究首先对多年生黑麦草的转化条件进行了优化，建立起根癌农杆菌介导的遗传转化方法。在选择的9种多年生黑麦草成熟胚诱导的愈伤组织中，经用根癌农杆菌侵染、百龙霉素选择，从4种多年生黑麦草材料中获得了抗性愈伤组织和抗性植株。
在利用报告基因进行转化中，金牌美达丽、神枪手、多福的抗性植株是由携质粒pCAMBIA2301的农杆菌EHA105转化后获得的。该质粒含有选择基因npt II和报告基因gus，均由CaMV35S启动子驱动。经PCR、GUS组织染色验证结果表明，绝大多数抗性植株是转npt II和gus基因的植株。其中金牌美达丽从1次转化中获得9株转基因植株；神枪手从2次转化中分别获得4和12苗；从3次转化中分别获得转基因多福植株17、18和15苗。最高转化效率可以达到4.3％。烟草汁在一定程度上有提高转化效率的作用。以质粒pCAMBIA2301为模板进行探针PCR地高辛标记，Southern bloting分析金牌美达丽9株转基因植株npt II基因，结果表明，转基因植株外源基因拷贝数低，其中6株为单拷贝，3株为2个拷贝，1株为多拷贝。
利美斯抗性植株是由携质粒p132的农杆菌EHAl05转化后获得的。该质粒中的nptII和绿色荧光蛋白基因gfp均受玉米泛素基因启动子控制。经PCR验证npt II基因，荧光体视显微镜观察及Western-bloting分析，结果证明了外源绿色荧光蛋白基因已整合在转基因利美斯中并稳定表达。从4次转化中分别获得10、21、11和12苗，转化效率分别为2.8％、3.3％、2.9％和3.0％。
利用接头盒连接巢式：PCR技术，分别对2株单拷贝的转基因金牌美达丽植株基因组进行T-DNA侧翼序列的扩增和克隆，获得2个T-DNA插入位点左侧翼多年生黑麦草基因序列，分别命名为LBSl和LBS2，长度分别为551bp和286bp。侧翼序列分析显示，T-DNA插入了宿主基因组，左边界序列发生了不同程度的缺失。LBSl连接的T-DNA左边界发生连同边界(25bp)及边界内(49bp)共74bp的缺失；与LBS2连接的左边界有3个碱基的缺失，以及与T-DNA连接处LBS2序列富含A／T核苷酸。这种T-DNA整合现象与双子叶植物及单子叶植物水稻、大麦中一致，表明T-DNA在多年生黑麦草基因组中的整合方式与双子叶植物及单子叶植物水稻、大麦等类似。2条T-DNA的侧翼序列间完全没有同源性，表明插入位点不同。推测T-DNA是随机整合到多年生黑麦草基因组中。据上述Southern-bloting结果表明，黑麦草基因组中可能也存在插入热点。
同源性分析结果显示，片段LBSl中部分序列与玉米NADH脱氢酶基因不同位点有不同程度的同源性，其中38-92bp区段同源性高达100％，最长区段同源性达98％，且该区段中388-542bp(155bp)与小麦NADH脱氢酶基因存在98％同源性，另外一些短片段如273-302bp与水稻NADH脱氢酶基因有96％的同源性，推测可能为线粒体NADH脱氢酶基因。片段LBS2中部分区段主要与麦类植物部分序列具有较高(89-90％)的同源性。
干旱应答因子结合蛋白DREBlB和TACBFl，分别克隆自拟南芥和小麦，受干旱应答基因启动子rd29Bp驱动。将这2个基因分别与pCAMBIA2301重组构建4个质粒p2325、p2326及p2327、p2328。然后分别将这些质粒导入根癌农杆菌EHA105，对多年生黑麦草愈伤组织进行转化。
从质粒p2328转化的多福中获得6株抗性植株。经PCR验证，nptII基因和目的基因片段存在于转基因植物中。Southern杂交结果表明，外源目的基因已整合到植物细胞基因组中。在正常条件下，转基因植株与野生型对照一样，生长良好，表明逆境诱导型启动子rd29Bp对植株生长的影响很小。对这6株转基因植株进行耐盐生理测试，用高盐250 mmoL／L的NaCl溶液处理，6d后观察到转基因植株生长良好，而非转基因植株叶片开始变黄；20d后转基因植株仍然能够存活而对照株枯黄，说明转基因植株比非转基因植株对高盐的耐受力有所提高。转基因植株抗旱测试，控水处理30d后复水，枯黄的对照植株不能复苏，而转基因植株尚能存活并恢复生长，说明转基因植株的干旱耐受性提高。这些研究结果为培育抗逆黑麦草新材料奠定了很好的基础。
在已有的研究基础上，对一些转化条件进行了筛选。根据愈伤组织诱导率和分化再生频率，农杆菌对愈伤组织生长的影响，愈伤组织对选择剂潮霉素、草丁磷、百龙霉素和卡那霉素的敏感性，农杆菌和愈伤组织共培养后gus瞬时表达率，共培养后愈伤组织恢复生长情况等，确立了在后续遗传转化研究的条件：转化材料选用从成熟胚诱导、继代培养不超过6个月的愈伤组织进行；质粒选用携nptⅡ为选择基因的pCAMBIA2301和p132；菌株选用EHAl05；共培养时间为3d；共培养后相应的选择剂用百龙霉素，浓度50 mg／L和100 mg／L交替进行。
转化条件的确立，为下一步进行多年生黑麦草遗传转化作准备。
多年生黑麦草;愈伤组织;根癌农杆菌;双元质粒载体;转基因植株;载体构建;抗逆反应
四川大学
博士
遗传学
张义正
2006
中文
S543.6;Q943.2
179
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）