一株产几丁质酶细菌的鉴定、酶的性质及其基因的克隆与表达
几丁质酶(chitinase Ec.3.2.14)能够催化几丁质水解为几丁寡糖和 N-乙酰氨基葡萄糖，广泛存在于各种微生物、植物及动物细胞和组织中， 参与多种生理过程。由于几丁质酶在生物防治和处理几丁质废物等方面 具有巨大的应用潜力，因而受到广泛的重视。
为了充分利用产几丁质酶微生物在生物防治中的潜力，作者用蛆蝇源几丁质作为筛选培养基，从土壤中初筛到51株产几丁质酶微生物，并通过生物测定法，复筛到一株对蝗虫有较高致死率的细菌C4。此外，通过观察蝗虫的中肠组织切片进行了初步的组织病理学研究。研究发现在 饲喂经几丁质诱导的C4菌液12小时后，蝗虫的中肠围食膜基本被破坏；在48小时后，中肠组织出现明显的组织病理症状。为确定该菌的分类地位，对细菌C4进行了形态学观察、生理生化指标测定及分子生物学鉴定。16S rDNA序列分析显示该菌与Sanguibacter，Oerskovia和Cellulomonas 三个属有较高的序列同源性，同源性分别为95.2-96.1％、95.4％和93.6-95.2％。结合表型特征和16S rDNA序列分析，细菌C4最接近 Sanguibactet属，因此初步将其归为Sanguibacter属，命名为Sanguibacter sp.C4。分别将经几丁质诱导的C4菌液(酶活力：1.16 U／mL)和未诱导的菌液饲喂蝗虫，诱导组蝗虫的死亡率(61.1％)明显高于未诱导组(35.6％)，表明细菌C4产几丁质酶与其对蝗虫的致病力呈显著正相关性。
为了提高细菌C4几丁质酶的产量，本文系统研究了碳源，氮源，起始pH值、培养基装量、培养温度和时间等因素对细菌C4产几丁质酶的影响。结果表明，碳、氮源分别以胶体几丁质、KN0<,3>和蛋白胨较好。在起始pH值7.6．8.5，培养基装量为三角瓶体积的12％，培养温度28℃，振荡培养(180 r／min)5 d时最有利于几丁质酶的产生。在此基础上采用均匀设计法优化了发酵培养基配方。优化后的培养基配方为：胶体几丁质1.5％，蛋白胨0.55％，KN0<,3> O.3％，MgS0<,4> 0.09％，Tween800.005％。在该条件下，几丁质酶活力达2.68 U／mI，比在原基础培养条件下的酶活力提高90.1％。
为了进一步研究细菌C4产几丁质酶的性质，作者通过硫酸铵沉淀，离子交换和凝胶过滤色谱对该酶进行了纯化。研究表明细菌C4产几丁质酶以单体形式存在，分子量为57-58.8 kDa，等电点4.2。最优的pH值和反应温度分别为4.6和37℃，并在pH,值3.0至8.O范围内保持稳定。此外，该酶在50℃作用30 min后，可保持75％以上的活性，在60℃作用30 min后，可保持50％左右的活性。Mn<'2+>对酶活性有轻微促进作用，而Fe<'2+>则强烈抑制酶活性。该几丁质酶的Km值和Vmax分别为6.95 mg／ml和10.53U／min·mg。为确定该酶的类型，作者通过薄层层析结合质谱分析对水解产物进行测定，结果表明该酶主要将胶体几丁质分解为几丁二糖，及少量的N一乙酰氨基葡萄糖，不能分解几丁二糖的类似人工合成底物pNP-GlcNAc，因此推断此酶为一种具有一定内切酶活性的几丁二糖酶。将不同浓度的几丁质酶与沙雷氏菌HR-3(一株蝗虫致病菌)的菌液混合后饲喂蝗虫。结果显示添加几丁质酶后，蝗虫死亡率均明显高于未加酶组，表明细菌C4几丁质酶对沙雷氏菌HR-3灭蝗具有增效作用。
克隆细菌-C4产几丁质酶基因并在大肠杆菌中高效表达对于从分子生物学水平上研究该几丁质酶及进一步进行大量生产都是非常必要的。在本研究中，作者首先通过几丁质酶基因的特异性PCR引物从细菌C4基因组中扩增到几丁质酶基因片断(chM-F)。将chiA-F序列提交GenBank数据库进行同源性搜索，结果显示该序列与数据库中已有的沙雷氏菌属(Serratia)、伯克霍尔德属(Burkholderia)和肠杆菌属(Enterobacter)中分离的几丁质酶基因有很高的同源性(93.1-99.6％)，表明在C4基因组中可能有相似类型的几丁质酶基因。通过比对分析从GenBank中获得的高同源性序列的保守区域设计2对PCR引物进行嵌套PCR，扩增出几丁质酶Chi58基因的开放阅读框(ORF)。该ORF序列由1692个核苷酸组成，编码563个氨基酸，在N端有23个氨基酸的信号肽，成熟蛋白的分子量应为58，544 Da。通过保守域分析，Chi58有两个保守结构域：—个ChiN结构域和一个18家族糖苷酶催化域。同源性分析表明Chi58的蛋白质序列与沙雷氏菌属、伯克霍尔德属和肠杆菌属中几丁质酶的同源性为88.9-99.6％。将Chi58基因克隆到pET32a(+)载体构建重组质粒pChi58，转入大肠杆菌BL-21(DE3)进行融合表达。经IPTG诱导后，可见分子量约81.1 kDa的融合蛋白Trx-chi58的表达。此外，作者对原核表达的条件进行了初步的优化。结果显示较适合的表达条件为：IPTG诱导终浓度l mmol／L_，培养温度37℃，诱导时间4 h。
几丁质酶;生物防治;分子生物学;基因克隆;基因表达
四川大学
博士
遗传学
刘世贵
2006
中文
S476.1
121
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）