mMIP-1α-DT390重组免疫毒素治疗小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的研究
自身免疫性疾病(autoinunune disease，AID)是由于各种原因导致机体免疫系统针对自身抗原发生免疫应答，产生自身抗体或自身致敏淋巴细胞，造成正常组织损伤而引起的一大类疾病，是公认的人类难治性重大疾病之一。目前临床上缺乏针对AID特效的治疗方案，常采用各种免疫抑制剂治疗AID，但这些制剂副作用大，会导致机体免疫功能的全面抑制。
人类多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种主要累及中枢神经系统的炎症性、多发性．AID，这种疾病具有症状复杂多变、缓解与复发交替进行、病程迁延不规律等特点，多年来一直困扰着患者。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是一种由活化T细胞(主要是Th1细胞)介导的器官特异性自身免疫性疾病，主要病理特征为血管周围炎性细胞浸润和神经脱髓鞘反应，在临床症状、生化指标及病理等方面与MS具有相似的特征，因此EAE被认为是研究的MS良好动物模型，也是Thl细胞介导的器官特异性AID的典型代表。
免疫毒素(immunotoxins，ITs)是一类将生物毒素与导向载体(抗体或细胞因子)连接起来构成的杂合分子。导向载体与某些细胞表达或过量表达的特异性抗原、糖类结构或细胞因子受体特异结合，携带的毒素分子到达特定的靶细胞，通过抑制蛋白合成或改变信号传递途径杀死靶细胞，同时不影响其它正常细胞的功能。因此，如果能构建一种可以靶向性杀伤抗原特异性活化T细胞的重组免疫毒素，就可能会达到预防和治疗EAE的目的。
本课题以活化T细胞(特别是Th1细胞)膜表面高表达的CCR5受体的配体巨噬细胞炎症蛋白-lα(maerophage inflammatory protein-1α，MIP-1α)基因片段作为导向分子，与白喉毒素活性片段DT390(diphtheriatoxin 390，DT390)基因重组成一种新型重组免疫毒素，构建真核表达质粒，质粒经阳离子脂质体包被后，用于治疗C57BL／6品系小鼠的EAE模型。通过观测小鼠临床症状、神经系统病理改变、外周血相关细胞因子水平动态变化、T、B细胞及Thl、Th2细胞数量及比例的变化，评估该重组免疫毒素预防和治疗EAE的效果。
方法
(1)通过RT-PCR方法，从小鼠肝脏中获得mMIP-1α基因片段；通过PCR方法扩增含有DT390基因的质粒获得DT390基因片段；将 mMIP-1α及DT390基因片段定向插入原核表达质粒pET-32a(+)构建重组质粒pET-32α(+)-mMIP-1α-DT390：重组质粒转化大肠杆菌JMl09，筛选出含有正确插入片段的阳性克隆；对重组质粒进行限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析；鉴定正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，Western-blot方法检测重组蛋白的表达。
(2)PCR扩增mMIP-1α-DT390基因片段，然后定向插入到真核质粒SRa中，构建重组质粒SRa-mMIP-1a-DT390；重组质粒转化大肠杆菌JMl09，筛选出含有正确插入片段的阳性克隆：对重组质粒进行限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析；鉴定正确的质粒用脂质体介导法转染NIH3T3细胞，免疫荧光法检测重组毒素的表达情况；MTT法测定mMIP-1α-DT390的生物学活性。
(3)使用改进的Kies法从新鲜牛脊髓中提取MBP粗提物，经SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白的浓度和纯度：将MBP粗提物与福氏完全佐剂(FCA)等量混和，制成油包水的乳剂，同时加入百日咳杆菌菌液，采用腹腔注射的方式诱导C57BL／6 小鼠的EAE模型。通过对实验动物的症状、中枢神经系统的病理改变及相关细胞因子水平的检测，评估EAE模型的构建情况。
(4)将上一步获得的真核表达质粒SRα-mMIP-1α-DT390经阳离子脂质体包被后，以肌注的方式治疗小鼠EAE模型。观测小鼠的临床症状、脑部病理改变、外周血T细胞相关细胞因子、T／B细胞及Thl/Th2细胞水平的变化，了解该重组免疫毒素的治疗效果。
结果
(1)通过RT-PCR法从小鼠肝总RNA中获得了210 bp大小的mMIP-1α基因片段：通过PCR方法获得了DT390基因片段；通过连接构建重组免疫毒素的原核表达质粒pET-32α(+)-mMIP-1α-DT390。重组质粒经过适当的限制性内切酶酶切分析及DNA测序证实：mMIP-lα及DT390基因片段正确插入到原核表达质粒pET-32a(+)中，并且目的基因的阅读框架保持不变；转化大肠杆菌BL21(DE3)后，Western-blot结果显示其细菌裂解物可与抗mMIP-lα及抗DT390的多抗结合，在杂交膜上显示出与预期分子量大小一致的约67 KD的条带。
(2)真核表达质粒SRα-mMIP-lα-DT390经过适当的限制性内切酶酶切分析及DNA测序证实，mMIP-lα-DT390基因片段正确插入到真核表达质粒SRα中；通过免疫荧光法检测证实：转染真核质粒在NIH3T3细胞中可瞬时表达目的蛋白：MTT法证实：细胞转染上清对ConA刺激的小鼠活化T细胞具有抑制效应，且该抑制效应具有剂量依赖关系。
(3)提取出的MBP蛋白粗提物浓度为1.337 mg／ml，SDS-PAGE的结果显示蛋白片段相对分子量约为17 KD，与预期值相符。实验组小鼠出现了EAE的典型症状，脑部病理切片显示：大脑皮质疏松，小脑脑膜下及脑膜血管周围大量CCR.5<'+>淋巴细胞浸润等改变，EAE模型小鼠外周血中IFN-γ水平明显升高，最高值达到337pg/ml。
(4)经重组免疫毒素mMIP-lα-DT390治疗的小鼠临床症状减轻，临床症状评分降低；冰冻切片免疫组织化学检测发现：CCR5<'+>细胞的数量明显减少；外周血EIJSA检测发现Thl细胞相关细胞因子IFN-γ表达降低，Th2细胞相关细胞因子IL-4表达无明显改变；流式细胞术分析发现：脾脏细胞T细胞及Thl细胞数量均降低；脾脏B细胞及Th2细胞数量未见明显改变；T／B细胞比例及Thl／Th2细胞比例均降低。
结论
(1)成功构建了一种新型重组免疫毒素mMIP-1 α-DT390原核表达质粒，并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了目的蛋白的表达。
(2)成功构建了一种新型重组免疫毒素mMIP-1 α-DT390真核表达质粒，并在真核细胞中瞬时表达，其转染上清对活化T细胞具有明显的细胞毒作用。
(3)利用自提的MBP成功诱导C57BL／6小鼠的EAE模型。
(4)重组免疫毒素mMIP-1 α-DT390对小鼠EAE模型有较为明显的防治效果。显示重组免疫毒素的基因治疗方法对防治自身免疫性疾病有一定的应用前景。
重组免疫毒素;活化T细胞;自身免疫性脑髓炎;基因治疗
四川大学
博士
法医学
张林
2006
中文
R593.2
128
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）