造血干细胞移植抑制肝癌术后复发转移的研究
肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，居我国癌症死亡的第二位。手术切除目前仍是治疗的最有效手段，但术后复发转移率高居不下，即使临床上公认预后较好的小肝癌，其5年术后复发率也达到了40％～50％。术后早期复发转移已成为阻碍肝癌病人长期生存的关键。随着分子生物学、肿瘤免疫学和基因工程技术的发展，以肿瘤免疫治疗为代表的肿瘤生物治疗作为综合治疗中重要的、具有巨大前途的部分为肝癌的治疗带来转机，被认为是最有可能清除残癌的方法。
近年来，造血干细胞以其特有的生物学特性及潜在的生物医学应用价值在恶性肿瘤治疗中越来越引人注意。早在1956年，Barnes等就报道移植了骨髓的小鼠能消灭照射残存的宿主白血病细胞。随后大量的研究表明，非清髓性移植和供者淋巴细胞输注在提高宿主对移植物的免疫耐受和诱导移植后病变复发的再缓解有显著作用，使人们意识到异基因干细胞移植卓越的疗效主要来源于供体细胞植入后产生的移植物抗肿瘤效应而非大剂量放化疗的清髓性预处理，大剂量的清髓性预处理实际上仍不能彻底杀死肿瘤细胞，反而增加相关并发症及病死率。目前，alIoHSCT作为治疗白血病等恶性血液病的有效手段已经广泛应用于临床，对于实体瘤的治疗研究正成为热点，目前主要应用于小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾细胞癌、结直肠癌等，并已取得可喜成就。
AIIoHSCT为患者引入了一整套健康的免疫系统，克服了肝癌患者本身的免疫功能缺陷，同时在肿瘤负荷较小时GVT的作用更为有效。因此我们设想在手术根治性切除肝癌主瘤体之后行AlloHSCT，异基因供体细胞可以在宿主体内持续性的发挥免疫治疗作用，清除残余肿瘤，从而抑制肝癌术后的复发转移。据我们查阅的文献，目前国内外尚未见alloHSCT用于抑制肝癌根治性切除术后复发转移的相关报道，因此我们想从异基因免疫治疗角度对肝癌术后复发转移的预防和治疗进行初步的探索，这也是本课题的特色和创新之处。
首先我们采用化疗预处理对严重联合免疫缺陷小鼠(severecombined immunodeficiency mice，SCID mice)进行脐血造血干细胞移植，成功的在SCID小鼠体内重建了人类免疫，并极大的降低了移植相关死亡率。随即我们采用人肝癌高转移细胞株HCCLM6以间接原位接种的方式建立人肝癌高转移动物模型，并在此基础上行根治性切除，从而评估了alloHSCT对肝癌术后复发转移的作用。同时我们采用荧光定量PCR(real time quantitative reverse transcription polymerase chainreaction，RQ-PCR)检测了小鼠外周血AFPmRNA和VEGF-CmRNA的表达水平，研究了其与术后复发转移的关系，探讨其作为临床预测指标的可能性。
第一部分造血干细胞移植动物模型的建立
目的：建立稳定的人一鼠造血干细胞移植模型，在保证一定嵌合率的情况下提高移植鼠的耐受能力以利于进一步实验，降低死亡率。
方法：采集足月健康胎儿新鲜脐血，以6％HES+NH<,4>CL破红细胞法分离人脐带血有核细胞(FIUCla‘ted cells，NC)，检测NC回收率及CD34<'+>细胞含量，立即使用或冻存备用。SCID鼠22只随机分为A组：程序移植组(n=8)；B组：单次移植组(n=8)；C组：生理盐水对照组(n=6)。两干细胞移植组内每只小鼠经尾静脉注入人脐带血NC共5×10<'7>个，三组小鼠移植前都给予低剂量的环磷酰胺预处理，并连续使用甲基强的松龙一周。六周后观测小鼠存活情况，流式细胞仪检测两干细胞移植组人源细胞嵌合情况。
结果： 采用6％HES+NH4CL破红细胞分离法的NC分离率为80.9％，CD34<'+>细胞回收率为71.6％，细菌培养(一)，冻存复苏后脐血NC活力由100％降至92～96％。移植后除程序移植组一只小鼠死亡外，所有实验组小鼠无死亡，未观测到移植物抗宿主病(Graft vesus hostdisease，GVHD)表现。环磷酰胺预处理之后3～5天外周血有核细胞降至最低，第二周时外周血白细胞计数恢复正常水平(1.93±0.33 vsl.98±O.286，p=O.546)，各组之间各时间段有核细胞计数差别无统计学意义。第六周流式细胞术检测程序移植组及单次移植组外周血CDT细胞嵌合率分别为1.66±O.47％和O.68±O.56％，差别有统计学意义(P<O.01)。
结论：6％HES+MJ<,4>CL破红细胞液分离法是一种成熟有效的分离方法，有较高的NC分离率及CD34<'+>细胞回收率，终体积小，污染机会少。通过化疗预处理及使用免疫抑制剂能够成功建立了人一鼠造血干细胞移植模型，但嵌合水平较低。程序移植方案可充分利用骨髓龛位，提高嵌合率。
第二部分 肝癌切除术后复发转移动物模型的建立
目的：建立稳定的模拟人肝癌根治切除术后复发转移的动物模型。
方法：首先进行高转移细胞株HCCLM6的细胞培养，观察细胞形态及细胞生长情况。然后将HCCLM6接种于裸鼠皮下获取瘤块，采用瘤块嵌插法建立SCID小鼠的间接原位肝肿瘤移植模型，10天后切除荷瘤肝叶，术后4周处死小鼠检测肿瘤复发转移情况。
结果：HCCLM6增殖速度快，倍增时间短，为32.8小时。首次手术无动物死亡，A、B、C各组平均手术时间分别为297±66s，325±55s。333±67s，差别无统计学意义(P=0.542)。10天后成瘤率为100％，各组肿瘤体积大小分别为25.58±3.20mm<'3>，27.80±3.90 mm<,3>，29.37±3.64 mm<,3>，差别无统计学差异(P=0.16)。二次手术单次移植组死亡2只，空白对照组死亡1只，各组手术时间分别为434±56s，436±64s，440±65s，差别无统计学意义(P=0.986)。未予处理的空白组小鼠术后的肝内复发率为100％(5／5)，复发瘤体积为811.38±127.36 mm<,3>，肺转移率为100％(5／5)，腹腔淋巴结转移率为40％(2／5)。
结论：HCCLM6是一个活力强、代谢活跃的肿瘤细胞亚群。通过间接原位移植的方法可以在SCID小鼠体内建立模拟人肝癌根治切除术后复发转移模型，具有非常高的复发率及很高的肺／淋巴结转移率，较好的模拟了HCC复发转移的生物学行为，是研究肝癌术后肿瘤复发转移的理想工具。利用此模型，将有利于深入研究肝癌的复发转移机理。
第三部分 造血干细胞移植对肝癌根治性切除术后 复发转移的影响
目的：证实造血干细胞移植对SCID小鼠肝癌根治性切除术后的复发转移有一定抑制作用。对SCID小鼠外周血AFPmRNA和VEGF-CmRNA表达水平进行定量检测，探讨其与肝癌复发转移的关系及其作为临床预测指标的可能性。
方法：造血干细胞移植后6周将HCCLM6肿瘤组织块原位接种于SCID小鼠肝脏，10天后对荷瘤肝叶行根治性切除，4周后处死小鼠，观察肝内复发和肝外转移的情况。RQ-PCR检测A、B、C各组外周血AFPmRNA和VEGF-CmRNA的表达水平。
结果：A、B、C各组肝内复发率均为100％，但复发瘤体积大小差异显著，分别为367.18±31.86mm<'2>、648.26±155.22 mm<'3>、811.38±127.36mm<'3>，两两比较差别均有统计学意义(P<0.01)。A、B两组的抑瘤率分别为54.7％和20.1％。各组间肺转移率分别为14.3％(1／7)、66.7％(4／6)、100％(5／5)，差别有统计学意义(P<0.01)。淋巴结转移率分别为14.3(1／7)、 33.4％(2／6)、40％(2／5)，差别无统计学意义(P=0.58)。AFPmRNA在各组的相对表达量分别为1.95±0.92、5.23±1.96、6.36±3.38、差别有统计学意义(P=0.02)。其中B、C组差别无统计学意义(P=0.69)。VEGF-CmRNA在各组的相对表达量分别为2.48±2.25、3.45±2.81、6.60±5.81，差别无统计学意义(P=0.27)。AFPmRNA相对表达量和复发瘤体积两者之间有正相关关系(r<,s>=0.88，P<0.01)。VEGF-CmRNA的相对表达量和复发瘤体积无相关关系(r<,s>=0.41，P=0.13)。AFPmRNA和VEGF-CmRNA的相对表达量两者之间有无相关关系(r<,s>=0.44，P=0.10)。AFPmRNA在有肺转移小鼠的表达水平高于没有肺转移的小鼠(5.79±2.67，1.96±0.92，P<0.01)，VEGF-CmRNA在有淋巴结转移小鼠的表达水平高于没有淋巴结转移的小鼠(8.09±4.90，2.21±1.56，P<0.01)。
结 论：在小鼠实验中，造血干细胞移植对肝癌根治性切除术后的复发和转移显示出一定的抑制作用，并且随着人源细胞嵌合率的增加，抗肿瘤效应也相应得到提高。肝癌术后外周血AFPm RNA／VEGF-CmRNA的水平与复发转移的发生率以及复发灶大小密切相关，提示外周血AFPIllRNA／VEGF-CmRNA可作为肝癌复发转移标志物，不仅有助于诊断，而且其水平高低对于评价病程、疗效和预后也有指导意义。外周血AFPmRNA和VEGF-CmRNA的表达水平无相关关系，联合检测两者结果可相互补充。
动物模型;造血干细胞;细胞移植;肝癌;分子生物学;肿瘤免疫学;基因工程
四川大学
博士
外科学
李波
2006
中文
R730.56;R735.7
106
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）