淋球菌外膜蛋白NspA在大肠杆菌中高效表达及其性能的初步研究
目的：淋病是性传播疾病中最常见、发病率排列第一的疾病；也是我国最常报道的性病之一，不仅发病人数最多，而且有逐年上升趋势，其感染还有增加HIV易感性的可能。目前常用的抗生素治疗虽然可以缩短淋球菌感染持续的时间并减少其传播，但近年来淋球菌耐药菌株的增多和新型耐药株的不断出现，这一策略已经陷入困境和危机，因此迫切需要寻求新的预防和治疗方法，而疫苗的研究是首选的策略之一。迄今为止，国内外尚无预防淋病的疫苗问世。最近对奈瑟菌外膜蛋白NspA的研究发现，NspA具有高度的抗原保守性，其保守性高于同样是淋球菌候选抗原的PI蛋白。NspA蛋白持续表达暴露在细胞表面，诱导产生的抗NspA抗体有溶菌活性，因此，NspA是一个潜在的制备淋球菌疫苗的候选抗原，可望用于制备成防治淋病的疫苗。
本研究通过扩增淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)外膜蛋白nspA(Neisseria surface protein A)基因，构建pET-NspA重组子，实现NspA重组蛋白在大肠杆菌中的高效表达，通过金属离子亲和层析纯化表达蛋白，免疫动物获得多克隆抗体血清，并对抗血清的性质进行初步研究，为后续研究淋球菌NspA的免疫学性能、相应的抗体制各及疫苗的研制奠定了基础，特别是为研制适合我国流行情况的相关疫苗奠定了坚实的基础。
方法：本研究分为三部分。
1．淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae)外膜蛋白NspA原核表达质粒的构建及序列分析根据nspA基因序列特性，设计三套引物，用PCR方法自淋球菌基因组中扩增nspA目的片段。利用限制性内切酶剪切产生的粘性末端将扩增所得片段与原核表达质粒载体pET30c(+)连接，构建重组质粒pET-NspA，首先转入克隆宿主E.Coli DH5a，利用卡那霉素抗性筛选阳性克隆，质粒小量提取后，双酶切及基因序列测定鉴定重组质粒。用blastn软件将测定所得的阳性重组子的基因序列与Genbank数据库中序列进行同源性比较，寻找相似序列；用DNAssist 2.0软件进行2条淋球菌标准株ndpA基因序列间的同源性比较，分析淋球菌标准株29400 29403与Genbank已报道的淋球菌，zspA基因序列问差异；同时使用blastp软件在Genbank中搜索与本研究中2条序列的氨基酸序列高度同源序列，并比较两淋球菌NspA氨基酸序列间的同源性。利用相关生物软件分析所构建的三套重组子的开放读码框架(0RF)和预期分子量(Mw)，使用RasWin M0lecular Graphics Windows Version 2.6、SWISS-MODEL等蛋白质结构预测软件预测NspA蛋白的二级结构和三级构型。将所得预测结果与已有研究结果进行分析比较，分析所得融合蛋白的立体构象及其暴露于膜外的抗原决定簇的几种100p结构区，为下一步研究奠定理论基础。
2.NspA融合蛋白的表达及纯化第一部分所得重组质粒pET-NspA转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3)，IPTG诱导NspA重组蛋白表达，优化重组蛋白的表达条件，SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况；筛选溶解包涵体的条件和获取融合蛋白粗提取物条件，选择镍金属离子亲和层析对NSpA重组蛋自进行纯化，优化离心法纯化重组蛋自各项条件，SDS-PAGE检测莺组蛋刍纯度及其分子量；使用抗His-Tag标签的单克隆抗体以wrestem blot法鉴定莺导表达的重组NspA蛋白。
3、淋球菌外膜蛋白NspA融合蛋白的免疫原性研究 根据第二部分筛。的镍金属离子亲和层析纯化NSpA重组蛋白的条件，大量纯化目的重组蛋，SDS-PAGE检测重组蛋白纯度及其分子量；选择新西兰大白兔和ICR小 按如下方式制各两种动物源性的多克隆抗血清。常规免疫方法，腹腔注 方式免疫ICR小鼠；常规免疫方法和快速免疫方法，以皮下多点注射方式 !新西兰大白兔。加强免疫三次后试血，效价达到要求后，心脏采血方式 兔血清，眼球摘除法收集小鼠血清。多克隆抗体的效价用间接ELISA 测定；以Western blot法检测多克隆抗体的反应性。所收集血清在加入 jNaN3后小管分装，于-70℃保存。
结果
1．成功构建了淋球菌标准株和临床株nspA基因的原核表达重组质粒pET-NspA，质粒经双酶切后，得到表达载体片段(5.kb)和目的基因片段(0.4～0.5kb)，与预期结果相符。
2．两淋球菌标准株的nspA基因经测序，目的基因全长471bp，在Genbank数据库中搜索到NspA-29400和29403的相似序列，与Genbank所公布淋球菌FA 1090的nspA基因序列比较，NspA-29400与其仅存在一个碱基的差异，同源性为99％；NspA-29403与之的同源性为100％；相应的氨基酸序列与Genbank数据库中淋球菌NspA氨基酸序列的同源性均在98％以上。
3．使用第一套引物获得的预期融合基因产物长度为544bp，相应的融合蛋白长为228个氨基酸，其预测分子量为24.17kD，该融合产物以pET系统的起始密码起始，包括nspA基因的前导序列和一个pET载体的5’端6×HisTag，以nspA基因的终止密码终止；使用第二套引物获得的预期融合基因产物长度为487bp，相应的融合蛋白长为209个氨基酸，其预测分子量为22.65kD，该融合产物以pET系统的起始密码起始，去除了nspA基因的前导序列，包含一个pET载体的5’端6×His Tag，以nspA基因的终止密码终止；使用第三套引物获得的预期融合基因产物长度为484bp，相应的融合蛋白长为222个氨基酸，其预测分子量24.44kD，该融合产物以pET系统的起始密码起始，去除了nspA基因的前导序列，包含pET载体的二个6×HisTag(5’端及3’端)，以pET的终止密码终止。
4．本研究所得NspA蛋白质序列包含4个完整的暴露于膜外的loop结构，loop区域是主要的抗原决定簇聚集的场所，其中保护性抗体与NspA蛋白的主要结合位点位于该蛋白的loop2和loop3区；预测的NspA-29400和29403蛋白质三维结构均为富含β-片层的环形筒状结构，暴露于膜外的四个环区构成了一个高度疏水的凹槽，符合已有报道。
5．SDS-PAGE结果显示，经IPTG诱导，第一套引物构建的重组子经诱导后，在预期分子量大小处未出现表达条带；经第二套、第三套引物构建的含pET-NspA的表达宿主菌E.coli BL21(DE3)在预期分子量大小处均出现明显的表达条带，所优化的诱导条件为1mmol/l的IPTG，37℃，2h后，表达量达最大。
6．使用抗His-Tag 单克隆抗体检测两组诱导表达成功的重组蛋白，BL21-pET-NspA-29400-2、BL21-pET-NspA-29403-2工程菌诱导所得蛋白不能被识别，BL21-pET-NspA-29403-3工程菌诱导所得蛋白可被该抗体识别。经过进一步分析，第二套引物构建的重组蛋白在进行Western blot检测时，可能是由于样品处理过程中5’端His-Tag丢失而不被检测，后续的镍亲和层析纯化重组蛋白的成功间接说明了该重组蛋白含有His-Tag。
7．选择含8mol／L尿素的50mmol／LPBS缓冲液(pH7.4)变性条件下溶解所得的以包涵体形式存在的重组蛋白，采用超声破碎的方法裂解细胞粗提融合蛋白，优化的超声条件为功率180W，4s工作，6s间隙，每次工作50次，直到破碎液变清亮。
8．优化了变性条件下，以FF胶通过大量离心法纯化两套引物构建的工程菌29403-423和29403-211重组NspA蛋白的条件，即采取含5mM咪唑的Bindingbuffer，含10mM咪唑的Wash buffer洗脱5～6次，最后以含300mM咪唑的Elute buffer洗脱目的蛋白，获得足够量的纯度较高的NspA融合蛋白。
9．以纯化蛋白免疫ICR小鼠和新西兰大白兔，获得足量的具备较高效价的两种动物源性的多克隆抗血清；通过Western blot检测其反应性，多克隆抗体可以与相应的诱导蛋白和纯化蛋白反应，并能与不含His-Tag的重组NsoA反应，该研究为进一步研究针对NspA抗体性能研究等奠定了基础。
结论：成功构建了淋球菌外膜蛋白NspA三套引物的原核表达重组质粒oET-NspA，实现了淋球菌NspA基因在原核细胞中的高效表达。通过序列分析，发现不同淋球菌菌株间的nspA基因同源性高于本实验室前期构建的外膜蛋白PI，且与脑膜炎奈瑟菌的nspA基因的同源性也高达98％。结构预测结果显示，该蛋白的主要抗原决定簇集中在其位于膜外的四个loop区中的L<,1>和L<,2>区，下一步研究重点可集中在这两个区域。使用镍金属离子亲和层析，通过离心法可在变性条件下简便快速地得到纯度较高的NspA融合蛋白，纯化产物用于免疫新西兰大白兔和ICR小鼠，获得了较高效价的多克隆抗体血清，该血清具备一定的免疫反应性。本研究为后期NspA蛋白相应性质的研究、相关抗体性能研究等奠定了基础，具有重要的理论意义和现实意义。
淋球菌;外膜蛋白;基因克隆;蛋白质表达;多克隆抗体;疫苗;奈瑟菌
四川大学
博士
营养与食品卫生学
张朝武
2006
中文
R378.16;R392.7
144
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）