一种基于“纳米酶”体系的DNA检测新方法
本文构建了一种用于DNA杂交检测的“纳米酶”体系。首先通过柠檬酸三钠还原氯金酸的方法制备粒径约15nm的纳米金颗粒（Au Nanoparticles，AuNPs)，利用蛋白分子与纳米金颗粒之间的相互作用，在纳米金颗粒表面连接辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)分子，然后利用金硫键的作用在纳米金表面组装末端带有巯基修饰的单链DNA检测探针，构成了一种以纳米金为中心的“rDNA-纳米金-HRP”结构的纳米单元，集成了靶物质检测与信号放大功能，被命名为“纳米酶”。
在应用该“纳米酶”体系进行夹心法检测DNA的实验中，首先在亲和素包被的磁性微粒(magneticmicroparticles，MMPs)表面组装上生物素修饰的DNA捕获探针，通过与靶DNA序列的杂交作用捕获游离在检测样品溶液中的靶DNA，经过磁性分离对产物进行富集之后，再与纳米酶进行杂交反应。洗脱非特异的吸附之后，加入显色底物ABTS(2，2’-Azino—bis(3-Ethylbenzthiazoline-6-Sulfonic Acid))或荧光底物HPPA(3-(4-Hydroxyphenyl)propionic acid)进行酶催反应。
结果表明，反应后产物溶液的光吸收值或者荧光强度与靶DNA的浓度在一定范围内呈良好的线性关系。由于一个纳米金颗粒上可以结合多个DNA和HRP分子，起到了信号放大的作用，且磁性微粒起到了浓缩样品、富集靶物质的作用，这种检测方法显示出良好的灵敏度和可重现性。采用显色底物反应，根据酶催反应产物在405nm处的吸光值绘制工作曲线，该方法对靶DNA的最低检测限在30pM左右，有效检测范围大约在100pM至3nM之间；采用荧光底物反应，反应产物在激发波长320nm,发射波长405nm条件下测得荧光强度，结果能够将检测极限降低到3pM左右，且具有更大的检测范围，大约在10pM至IOnM之间。在对照实验中，这种应用“纳米酶”的杂交检测体系表现出良好的特异性，用不能与探针互补的DNA作为阴性对照，与含有靶DNA的阳性对照、不含任何DNA样品的空白对照进行平行实验，结果显示，阴性对照与空白对照产生的信号强度相当，远远小于含有较低浓度的靶DNA的阳性对照所产生的信号。
此外，本文对于在建立该检测系统的过程当中所遇到的一些问题，如非特异性吸附、底物的选择等进行了讨论，总结了目前该检测方法存在的一些不足，提出了下一步工作的方向，并对纳米酶技术的应用前景进行了展望。
纳米酶;纳米金;辣根过氧化物酶;DNA检测;探针
四川大学
硕士
遗传学
赵云
2006
中文
Q789
59
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）