单引物PCR扩增效率及甘蓝型油菜Toc33基因启动子的分离
单引物PCR是一种只用一条引物就可以克隆已知序列侧翼未知区域的染色体步移方法。它利用引物在低严谨条件下会与模板发生错配结合的特性，使一端引物与已知序列退火，而另一端引物则与未知侧翼区的部分相似序列退火来实现完整的PCR扩增。为了研究引物的长短对扩增效率的影响，分别设计了三组长为6、8、10碱基的短引物以及一组19和22碱基的长引物，以甘蓝型油菜基因组DNA为模板进行单引物PCR扩增，用电泳检测扩增产物并割胶回收较明亮的条带，再用巢式PCR鉴定扩增产物和回收产物。电泳结果显示，通过低严谨扩增、两步法扩增或者高严谨扩增，长引物的扩增产物大多能获得清晰明亮的带型但都不含目的序列；6个或8个碱基的引物其扩增产物弥散或者根本检测不到：10条10碱基引物中的8条可以产生比较清晰、带型丰富的扩增产物，而7条引物的扩增产物经鉴定呈阳性，扩增产物的总体阳性率达70％；从扩增产物中一共回收了34条DNA片段，鉴定呈阳性的有17条，回收DNA的平均阳性率为50％。当进行两轮单引物PCR扩增时，25种扩增产物中有20种鉴定呈阳性，扩增产物的总体阳性率提高到80％。因此，本实验中的长引物(19、22碱基)不适合单引物PCR；在较短的引物中，6、8碱基引物不适用于单引物PCR，而10碱基单引物PCR则是一种可行性较高的染色体步移策略。
启动子是基因表达调控的重要顺式作用元件，为了了解叶绿体上的外膜蛋白转运器构件蛋白基因Toc33的转录调控机制，以甘蓝型油菜基因组DNA作为模板，从设计的一组10碱基引物中选取C3和C4进行两轮单引物PCR扩增，在C3的首轮和第二轮扩增产物中分别克隆到长为1400 bp和613 bp的两条目的片段。同源性比对的结果表明，大片段3’端491bp为Toc33基因的部分编码区，而5’端909bp则为该基因的侧翼序列；小片段3'端497bp为Toc33-like基因的部分编码区，而5'端116bp则为该基因的侧翼序列。Toc33基因的5'侧翼区共含有5个TATA盒、6个CAAT盒、1个G盒、4个GATA盒、1个I盒、9个GT1CONSENSJS基序、1个SORLIPlAT基序和1个CIACADIANLELHC基序，而拟南芥和截形苜蓿Toc33、Toc34基因的5'侧翼区也含有多种相同或相似的、与植物光调控以及激活基因转录相关的顺式作用元件。经四种启动子的同源性比较与亲缘树分析，推测Toc33和Toc34的调控序列进化上并不保守。
甘蓝型油菜;单引物PCR;启动子;序列分析;基因表达;Toc33基因
四川大学
硕士
遗传学
赵云
2006
中文
S601;S634.3
89
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）