甘蓝型油菜矮化突变体“NDF-1”抑制性消减文库的构建和BnD5、BnD11基因全长cDNA的克隆
为了探究矮化性状突变的分子机理，本实验应用抑制性消减杂交(suooression subtractive hybridization，SSH)技术构建了甘蓝型油菜矮化突变体“NDF-1”的抑制性消减文库。经菌落PCR检测，消减文库的有效重组率为90％，其中插入的cDNA片段大小在100bp到1000bp之间。再通过斑点杂交对100个随机挑选的含有插入片段的阳性克隆进行初步地差异筛选，然后选取32个阳性克隆进行序列测定。用DNAMAN序列分析软件对测序结果分析比较，cDNA序列在GenBank数据库中进行同源性比较。结果显示，有3个克隆未出现测序结果；在另外的29个克隆中，4号和11号克隆完全重复，6号和12号克隆完全重复，非重复率为86.2％，其中，17个序列与己知蛋白或推测蛋白质(putativeprotein)有着较高的同源性，功能涉及到以下几方面：第二信使、转录因子、衰老、蛋白质降解、脂肪酸代谢、脂肪酸转运及储存，其余的12个克隆与未知蛋白质(unknown protein)或假想蛋白质(hypothetical protein)同源，暂不能确定功能。
以甘蓝型油菜(Brassica napus)矮化突变体“NDF-1”苔期的顶端和侧生幼叶为材料提取RNA，在已经构建的油菜矮化突变体“NDF-1”消减文库中选取一个已经测序的编码半胱氨酸蛋白酶的基因片段和一个编码植物特有的转录因子WRKY的基因片段，设计特异引物并应用逆转录合成的cDNA和RACE-PCR技术，克隆得到这两个基因片段的cDNA全序列，分别命名为 BnD5和BnDll。序列分析表明，BnD5cDNA的开放阅读框为1080bp，编码359个氨基酸；BnDllcDNA的开放阅读框为810bp，编码269个氨基酸。对推测的氨基酸序列的组成、同源性进行了分析。发现推测的BnD5氨基酸序列与甘蓝中一个功能为半胱氨酸蛋白酶的蛋白质有较高的同源性(96％)，BnDll氨基酸序列与AtWRKY有很高的同源性。随后又对它们的活性位点、亲水性以及二级结构进行了初步预测，BnD5含有半胱氨酸蛋白酶的三个活性位点，BnDll含有一个WRKY结构域和一个锌指纹结构(CX7CX23HXH)，它们的二级结构都含有大量的α-螺旋、β-转角和无规则卷曲。另外，我们还预测到BnD5含有三个二硫键和一个跨膜结构域，推测它可能是个跨膜蛋白；BnDll有两个核定位信号序列(NLS)，其一为KKRK，另一个为KKQR。
甘蓝型油菜;抑制性消减杂交;RACE-PCR;氨基酸;矮化突变体;cDNA克隆
四川大学
硕士
遗传学
王茂林
2006
中文
S634.3;S601
77
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）