刺参器官再生的组织学与相关基因研究
器官和组织的形成是发育生物学中没有解决的神秘的问题。一个器官的形成已经证实很难去解剖，部分是因为这个过程非常连续而且复杂，同时也是因为大部分器官是在胚胎期发育，而这些过程是相互联系的，所有的这些使得研究一个特异的过程非常难。器官再生在成年动物当中也可能发生，尽管范围非常有限，包括丢失的器官的再生。一旦此过程发生，这个过程就可能从空间上分离开来，并且这个暂时的发育事件就可以作为器官生成的一个系统模式来研究。成年动物的器官再生的一个最显著的事件就是海参纲成员在吐脏后能够再生出多种器官。刺参能够在吐脏后迅速再生出其身体器官。新的消化道的发育是一个复杂的过程，包括基因表达的改变，从而导致了有关再生的细胞结构，免疫防御，细胞信号转导等方面的改变。
我们将刺参作为一个模型系统利用组织学及现代分子生物学技术来研究刺参的再生。本研究以中国山东地区的养殖刺参(Apostichopusjaponicus)为研究材料，刺参体长10～15cm，通过注射KCI(0.35moi／L)诱导吐脏。采用组织学方法对刺参吐脏和再生进行了观察，结果显示刺参吐脏后便开始再生，吐脏后的第2天可观察到呼吸树主干及分支结构。腹部肠系膜在吐脏后逐渐增厚，第5天可观察到肠上皮与肌肉组织，再生出新生肠管的时间大约为2周。
表达序列标签(Expressed Sequence Tag，EST)技术是近年兴起的一种高通量基因筛选和鉴别的有效方法。本研究利用EST技术对刺参的再生肠组织和正常肠组织表达序列进行大规模测序分析，旨在从EST数据中寻找与刺参再生相关的基因，同时也为今后刺参再生功能相关基因的筛选与克隆奠定良好基础。本文用表达序列标签方法，对刺参肠再生过程中的表达基因进行了鉴定。
为了研究刺参再生肠组织与正常肠组织当中的差异表达基因，通过定向克隆法，构建了刺参正常肠组织的cDNA文库(NE)和吐脏后第3-5天再生肠组织的cDNA文库(PE)：从每一个文库中取400个阳性克隆从5’末端进行测序，并对EST序列进行分析。首先，从刺参的再生肠组织和正常肠组织提取mRNA，然后反转录成cDNA，将反转录成的双链eDNA与载体连接构建质粒eDNA文库。结果显示从再生肠组织的cDNA文库当中获得了1.5×10<'6>个独立的阳性克隆，而从刺参的正常肠组织当中获得了1.8×10<'6>个独立的阳性克隆。在经过一系列的包括载体去除，文件格式转换，丢弃低于100bp的低质量的序列后，从文库中获得了730个5'端ESTs，从PE与NE文库中各获得了372和358个EST。PE与NE文库中的平均EST序列长度分别为558bp和528bp。所测得的数据经过PHraP聚类拼接后，从PE文库当中获得26个contigs与304个singletons，从NE文库当中获得18个contigs和295个singletons。将拼接后的结果进行BLAST比对，结果显示刺参再生肠组织文库当中148个ESTS与GenBank(中已知序列具有较高同源性(E-value<0.005)，而在NE文库当中为157个ESTs。在两个文库当中未发现同源序列的EST较多，在PE文库当中为55％，在NE文库当中为50％。发现PE文库中与细胞免疫、细胞分裂和细胞信号转导相关的基因表达量明显多于NE文库、而与基本代谢有关的基因表达量少于NE文库。此结果说明，吐脏后第3-5天与再生相关的基因大部分已被激活。分析表明，两个文库中只有11.54％的转录本共同出现，可以表明再生肠组织和正常肠组织存在着明显的基因表达模式差异。
本研究采取大规模的EST测序方法，结合cDNA末端快速扩增技术，直接从刺参再生肠组织cDNA文库中分离、克隆获得了刺参室管膜蛋白基因的全长cDNA序列。刺参室管膜蛋白的分子量在30.167kd之间，为酸性蛋白质。经计算推导，刺参室管膜蛋白全长氨基酸序列与海参(H.glaberimmα)，及两种海胆(HMexicana、Lvariegatus)、的相似性分别为55.3％，68.5％，68.1％。常规RT-PCR表明刺参室管膜蛋白在刺参再生过程中过量表达。
此外，还获得了刺参枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因、凝集素基因的全长cDNA序列，并且对这些刺参再生相关因子进行了全面的生物信息学分析。
这些研究结果为进一步大规模克隆和筛选刺参参与刺参再生过程的相关基因，研究刺参再生的作用机理和调控机制，丰富和发展组织与器官再生方面的研究内容，全面了解和认识刺参的再生机理，进而指导组织与器官的再造都具有重要的理论指导意义。
刺参;再生组织学;室管膜蛋白基因;凝集素
中国海洋大学
博士
海洋生物学
孙修勤
2006
中文
Q178.53;Q954.48
144
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）