牙鲆淋巴囊肿病毒在牙鲆鳃细胞系（FG）中的增殖以及在鱼体中组织嗜亲性研究
牙鲆(Paralichthys olivaceus)，英文名为Olive flounder，Bastard halibut，Japanese flounder等。在我国俗称牙片、偏口、比目鱼，因其体色又名褐牙鲆，是名贵的海产鱼类，又是重要的海水增养殖鱼类之一。淋巴囊肿病是近年来对我国沿海养殖鱼类危害较大的一种病毒性疾病，其病原为淋巴囊肿病毒(Lvmphocystis disease virus，LCDV)。20世纪90年代，淋巴囊肿病的爆发给我国牙鲆养殖业带来了巨大的经济损失。
本文使用牙鲆鳃细胞系(Flounder gill，FG)进行病毒培养，在光镜下可见培养细胞有明显CPE症状出现。将培养细胞收集、超薄切片后进行电镜观察，发现培养细胞中有典型的呈五边形或六边形的病毒粒子，大小为220～290 nm，衣壳大小为190～240 nm，其核心直径为130一140 nm。在胞质中发现病毒的包涵体。收集接种病毒后的培养细胞，酚／氯仿法提取DNA后，根据编码LCDV主要衣壳蛋白(Major capsidprotein，MCP)基因中间保守序列设计引物，通过PCR扩增，获得454 bp长度的特异性DNA片段。证明FG细胞可以作为LCDV的敏感细胞系。
对LCDV在体外培养FG细胞中的增殖周期进行了研究，电镜观察发现病毒感染并吸附细胞后8 h内即可完成一个复制周期。接种病毒后2 h的细胞结构完整，细胞器没有病变，细胞内未观察到病毒粒子，但可观察到大量病毒正在吸附及侵入培养细胞，病毒形态规则，大小在220～290 nm之间。接种6 h的细胞形态仍然正常，细胞器没有明显病变，病毒大都在侵入细胞，在细胞质内可见形态典型的病毒粒子，表明有些病毒已侵入细胞，胞质内病毒粒子大小也在220～290nm之间，与细胞外病毒大小没有明显差别。接种10 h的细胞内开始出现大量病毒粒子，病毒的大量复制和释放导致宿主细胞出现显著的病理变化，线粒体空泡化，内质网网池扩张。接种24 h的细胞内病毒数目很多，大多数病毒正在释放。
接种14d病毒的形态开始改变，为非典型的二十面体。病毒增殖周期的PCR检测结果也符合电镜结果。通过细胞培养研究LCDV体外增殖周期尚未见报道。本文根据葡萄球菌蛋白A能与牙鲆IgM抗体特异性结合的性质，进行感染灶实验(FIA，focal infectivity assay)，能够灵敏的检测到培养细胞中的LCDV。通过FIA的方法检测培养细胞中的LCDV尚未见报道。
本文通过MTT比色法测定了FG细胞在感染LCDV后的活性，具体反映为580nM处的光吸收值，并根据Reed-Muench法和Karber统计法分别计算了LCDV的细胞培养半数致死量(50％cell culture infectious dose，CCID50)，以CCID50来表示病毒的滴度。目前尚未见有利用MTT比色法测定LCDV滴度的报道。
本文还利用电镜技术和PCR对淋巴囊肿病毒侵染牙鲆的组织嗜亲性进行了研究，发现鳃、肌肉、头肾、体肾、脾、肠、胃、心脏、精巢和胆囊为病毒的靶器官。在肝脏中未观察到病毒粒子，也未检测到病毒DNA的存在。PCR扩增的结果表明，在病鱼的不同感染时期淋巴囊肿病毒侵犯的靶器官可能不同：在病变严重的鱼中，病毒可以广泛感染鱼体除肝脏以外的绝大部分器官，包括胃及肠，而在感染较轻的病鱼中，病毒仅侵犯到某些组织，比如鳃、肌肉和肾等器官，在胃及肠中均未发现病毒的存在。在不同程度感染的病鱼鳃中均检测到病毒DNA，表明鳃是淋巴囊肿病毒入侵鱼体的一个主要门户。
牙鲆;淋巴囊肿病毒;细胞培养;增殖周期;组织嗜亲性
中国海洋大学
硕士
海洋生物学
汪岷
2006
中文
S941.41;S965.3
72
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）