文昌鱼尿素酶辅助蛋白UreG基因的克隆、特性、进化分析和组织特异性表达的研究
在动物的进化历程中，文昌鱼是介于无脊椎动物与脊椎动物之间的过渡类型。利用分子生物学手段，研究文昌鱼有关基因的结构、进化和表达，不仅可为我们从分子水平上解开脊椎动物起源的奥秘，而且还可以从进化的角度进一步揭示有关基因的功能。
尿素酶足存在于许多细菌、真核微生物、真菌、植物以及无脊椎动物中的蛋白分解酶，它可以将尿素分解为氨气和二氧化碳。研究认为尿素酶蛋白活性的发挥要依赖于尿素酶辅助蛋白的激活。尿素酶辅助蛋白基因编码的蛋白在金属镍离子聚合到酶活性位点上起重要作用。在四种主要的辅助蛋白UreD、ureE、UreF和．IJreG中，UreG的保守性最高，在整个尿素酶激活过程可能起到结合GTP，水解GTP的作用。
迄今为止，尿素酶辅助蛋白UreG基因只在细菌、真菌和植物里有报道，在动物里尚未发现。我们在文昌鱼肠cDNA文库的大规模测序中，得到一个与尿素酶辅助蛋白UreG基因有高度相似性的克隆L239，(GerLBank accession nLJmber：AAT39417)。它全长966 bp，含有一个603bp的开放阅读框(ORF)，编码一个由200个氨基酸残基组成的蛋白，其推导的分子量为22．41 kDa，等电点为6．6。该基因包括一个5’起始密码子和3’的终止密码子；在78bp的3’非翻译区有一个多聚腺氨酸尾巴，在284bp的5’非翻译区还有一框内终止密码子和一个多聚嘌呤区域，表明该cDNA克隆具有完整的编码区。为了排除肠中微生物污染的可能性，我们又以文昌鱼肠以外的组织为模板对该基因进行了RT～PCR和巢式PCR分析，实验结果都呈阳性；以该克隆为探针进行的切片原位杂交试验显示在消化道外的组织中也有表达。这些都证明克隆L239确为文昌鱼本身的基因转录产物。有趣的是，对巢式PCR产物的内含子、外显子的结构和特殊的剪接位点的分析都表明克隆L239编码的是一个真核生物基因而不是转录中的假基因。将该基因编码的蛋白，通过NCBI上的BLASTP工具检索，发现该蛋白与尿素酶辅助蛋白UreG有很高的相似性。文昌鱼尿素酶辅助蛋白UreG的氨基酸序列与真菌、植物和细菌尿素酶辅助蛋白UreG的相似性分别为46～49％，44～48％，和29～37％。序列对比分析发现，它与细菌、原核微生物、真菌和植物的尿素酶辅助蛋白UreG具有相同的结构特征：多肽链都含有一个高度保守的p-loop区域。系统进化分析表明文昌鱼尿素酶辅助蛋白UreG介于细菌尿素酶辅助蛋白ureG与真菌尿素酶辅助蛋白Ure6之间，是一个独立的进化分枝，进一步表明了该基因不是微生物的污染物。组织切片原位杂交结果显示AmphiUReG在文昌鱼中的表达有组织特异性：腮、内柱、肠和卵巢的卵细胞等组织中表达较强，而在肌肉、脊索、精巢等组织里仅有微量表达。这个结论和以前的报道尿素酶辅助蛋白UreG基因在植物各组织中广泛表达是不一致的，提示尿素酶辅助蛋白ureG基因可能在动物和植物体内存在着某些差异。尿素酶辅助蛋白UreG基因在文昌鱼消化道里具有较强的表达丰度，说明尿素酶辅助蛋白UreG的功能可能在文昌鱼消化过程中发挥着重要作用。
通过本实验我们验证了文昌鱼中存在尿素酶辅助蛋白UreG基因，证明文昌鱼中存在尿素酶着尿素酶活性，这为我们对文昌鱼尿素酶的进一步研究提供了思路和线索，为我们对生物尿素代谢途径的研究奠定了基础。
文昌鱼;UreG基因;特异性表达;系统进化分析;尿素酶
中国海洋大学
硕士
遗传学
张士璀
2006
中文
Q959.287;Q754
85
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）