胞红蛋白（CGB）与金属硫蛋白Ⅱ（MT2）相互作用的研究
本研究采用酵母双杂交技术，筛选胞红蛋白(Cytoglobin，CGB)相互作用分子，从人的胎脑cDNA文库中筛选鉴定了金属硫蛋白Ⅱ(MetallothioneinⅡ，MT2)为CGB的一个相互作用蛋白。并采用酵母回转，细胞内共定位实验验证该相互作用；同时，采用RT-PCR检测CGB在氧化损伤模型下的mRNA的水平变化，荧光显微镜观测CGB与MT2相互作用的共定位变化；并成功获得CGB的原核表达产物，为进一步深入探讨相互作用分子的生物学功能奠定了基础。本研究包含以下几方面内容。
1.胞红蛋白相互作用分子的筛选。构建了胞红蛋白酵母双杂交载体，确认CGB重组载体在酵母菌株AH109中成功表达且无自激活活性后，筛选人胎脑cDNA文库，共得到56个阳性克隆；对其进行PCR扩增后连接到pGEM-T载体上进行测序鉴定，共得到44个序列，生物信息学分析其中的一个克隆C71与MT2的序列完全一致。
2.胞红蛋白与金属硫蛋白Ⅱ相互作用的确认。采用酵母回转实验对上述筛选确定的CGB与MT2的相互作用进行验证，结果表明MT2自身不具有自激活活性，说明MT2与CGB在酵母内可以发生相互作用；COS7细胞内共定位实验结果显示，过表达CGB主要在胞浆分布，少量在胞核分布，MT2过表达在胞浆中分布，CGB和MT2共表达后二者存在共定位，一部分在胞浆点状共定位，一部分在胞核点状共定位。进一步证明了CGB与MT2在胞内确实可以相互作用，并且CGB可能具有募集MT2入核的功能。
3.CGB在氧化模型下的表达及与金属硫蛋白Ⅱ共定位的变化。通过RT-PCR实验检测CGB在ZnSO4模拟细胞氧化损伤时的表达变化，发现当ZnSO4浓度大于75μM处理时CGB表达量显著升高；100μM处理下6小时CGB的表达量已显著升高，12小时达到峰值而后下降，48小时CGB的表达量仍显著高于对照组。同时ZnSO4处理后，CGB与MT2共定位明显移位于胞核内，提示二者相互作用可能与氧化损伤导致的DNA损伤保护反应相关。
4.胞红蛋白表达产物的获得。成功构建胞红蛋白原核表达载体，并成功表达，获得大量有活性的胞红蛋白原核表达产物。
以上研究我们得出如下结论：首次发现胞红蛋白与金属蛋白Ⅱ存在相互作用；胞红蛋白与金属蛋白Ⅱ相互作用与机体氧化损伤应答密切相关。
胞红蛋白;共定位;氧化损伤模型;金属硫蛋白;蛋白原核表达;酵母双杂交技术;筛选;表达量;原核表达载体;定位实验;金属蛋白;生物信息学分析;自激活;相互作用蛋白;细胞氧化损伤;细胞内;活性;分子;分布;蛋白相互作用
西北农林科技大学
硕士
遗传学
刘小林;张成岗
2006
中文
Q756
73
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）