低氧诱导因子1α（HIF-1α）在喉鳞癌中的表达及其临床意义的研究
缺氧是人类和动物实体肿瘤的一个共同特征。低氧诱导因子1a(hypoxiainduciblefactor1α，HIF-1α)是机体在低氧条件下产生的一转录活化因子，它能指导多种低氧反应基因的转录，为机体适应低氧，维持内环境稳态的一个重要因素。当周围环境的氧浓度下降时，HIF-1α表达增加，并且其表达增加表现在多个水平上，包括转录和蛋白等水平，但主要是蛋白水平明显增多。HIF-1α是HIF-1的一个亚基，是唯一的氧调节亚单位，HIF-1α的活性是HIF-1的决定性成分，其活性对维持肿瘤细胞的能量代谢、新生血管形成以及促进肿瘤的增殖生长、侵袭和转移起着重要作用，并受多种因子的调控和影响。在多种恶性肿瘤中都存在HIF-Ⅰα蛋白的过表达，并与预后不良密切相关。HIF-1α与肿瘤的关系已成为近年来肿瘤学研究中的一个新的热点。有关HIF-1α与喉鳞癌发生发展关系的研究，目前国内尚未见报道。本实验首先从人喉鳞癌实体瘤入手，应用免疫组织化学技术了解缺氧诱导因子1α(HIF-1α)极其相关调控因子与喉鳞癌生物学行为的关系；进而通过体外细胞培养，从分子水平探讨低氧条件下，缺氧诱导因子1α(HIF-1α)及其相关调控因子在头颈肿瘤中的表达及相互作用机制，进一步明确HIF-1α与化疗抵抗的关系；在此基础上进行靶向HIF-1α活性及表达的实验，深入探讨以缺氧为靶点对治疗头颈肿瘤及化疗增敏的潜在临床价值。
方法：
1HIF-1α在喉鳞癌中的表达及其与喉鳞癌生物学行为的关系。标本选自河北医科大学病理教研室2001年1月1日-2004年12月31日术前未经治疗的喉声门上型癌、喉咽癌病人63例标本，其中男59例，女4例；中位年龄56岁(43～72岁)。根据国际抗癌协会(UICC)标准(1997)确定TNM分期。喉癌分型：喉声门上型癌42例，喉咽癌21例；临床分期：Ⅰ期8例Ⅱ期11例、Ⅲ期14例、Ⅳ期30例；病理学分级：鳞癌Ⅰ级15例，鳞癌Ⅱ级29例、鳞癌Ⅲ级19例；病理证实颈部淋巴结转移组41例，无转移组22例。取癌旁正常粘膜组织20例作为对照。所有标本均一部分迅速置于液氮罐中保存，一部分标本离体后2小时内放入10％中性福尔马林中固定24小时，石蜡包埋，常规病理HE染色，所有标本均经两位副高以上职称的病理科医生确定病理性质和病理学分级。肿瘤组织均病理证实为鳞状细胞癌，喉癌旁正常粘膜病理为正常喉组织。
1.1免疫组织化学染色方法对喉鳞癌63例标本进行检测，其中病理证实颈部淋巴结转移组41例，无转移组22例。取癌旁正常粘膜组织20例作为对照。指标为HIF-1α、VEGF、P53。结果判定：每例标本以400倍光镜下随意选取10个视野，计数每个视野中100个肿瘤细胞中的阳性细胞数，取其平均数求其阳性百分率作为结果。平均阳性细胞所占比例≤5％判定为阴性，阳性染色细胞＞5％判定为阳性。
1.2流式细胞仪对转移组患者的原发灶、淋巴结转移灶以及非转移组标本检测HIF-1α、VEGF、P53蛋白表达进行定量分析，取石蜡标本切片(40μm厚)，网搓法制备单细胞样品。在对蛋白免疫荧光标记物测定时，设一抗或二抗的本底对照和阴性对照。采用美国BeckmanCoulter公司生产地Epics-XLⅡ型流式细胞仪进行检测。以荧光指数(FI)表示蛋白表达产物的相对含量，FI=(瘤细胞表达的平均荧光强度/正常对照样品平均荧光强度)。荧光指数(FI)可相对客观的反映蛋白的表达程度。
1.3用TrizolReagant进行组织总RNA提取，采用RT-PCR试剂盒对提取的总RNA进行RT-PCR反应，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果在紫外凝胶投射分析系统中照相分析，分别比较HIF-1αmRNA在喉鳞癌组织和癌旁正常粘膜组织中的表达水平，分析其基因表达调控水平。
2低氧对喉鳞癌细胞系Hep-2HIF-1α及其相关基因表达的影响：人喉鳞癌细胞Hep-2分成3组：缺氧12h组、缺氧24h组及对照组。缺氧组分别在缺氧条件下(37℃，5％CO2，2％O2饱和度)培养12h和24h，对照组置于正常氧浓度条件下(37℃，5％CO2、21％O2饱和度)培养24h。流式细胞仪分别测定3组细胞周期及HIF-1α、突变型P53、VEGF表达，免疫组织化学SP法分别测定3组细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、P53、VEGF表达。RT-PCR检测各组细胞HIF-1αmRNA的表达水平。
结果：
1HIF-1α在喉鳞癌中的表达及其与喉鳞癌生物学行为的关系。
1.1免疫组化染色结果显示(1)HIF-1α蛋白在癌旁正常喉黏膜中几乎无表达，在喉鳞癌组织中主要于细胞胞浆中可见致密浓染的棕色颗粒，部分切片显示其在胞浆及胞核中均有表达。(2)有颈淋巴结转移组HIF-1α蛋白表达(82.9％)明显高于无淋巴结转移者(54.5％)(P＜0.05)。(3)HIF-1α蛋白表达与喉鳞癌病理分级及临床分期相关。(4)喉癌淋巴结转移组中原发灶HIF-1α蛋白表达阳性率为82.9％低于其淋巴结表达的阳性率95.1％，但经X2检验二者无明显差异(P＞0.05)。(5)转移组原发灶HIF-1α蛋白表达与喉癌、下咽癌临床分期和病理分级有关(P＜0.05)；转移组淋巴结HIF-1α蛋白表达与喉癌、下咽癌临床分期及病理分级均无关(P＞0.05)。(6)淋巴结转移组VEGF、P53蛋白表达阳性率(70.7％，68.3％)高于非转移组(40.9％，36.4％)(P＜0.05)；⑦喉鳞癌淋巴结转移组的转移淋巴结VEGF、P53蛋白表达阳性率(87.8％，80.5％)均高于其原发灶(70.7％，68.3％)，但经X2检验二者无明显差异(P＞0.05)。
1.2流式细胞仪对转移组患者的原发灶、淋巴结转移灶以及非转移组标本检测HIF-1α、VEGF、P53，结果显示(1)转移组与非转移组肿瘤细胞HIF-1α蛋白表达的平均FI分别为5.33±0.16和2.27±0.18，t检验显示两者间差异有统计学意义(t=1.36，P＜0.05)。(2)转移组原发灶与其转移淋巴结肿瘤细胞HIF-1α蛋白的平均FI分别为5.33±0.16和10.53±1.1，配对t检验显示两者间差异有统计学意义(t=10.36，P＜0.05)。(3)喉鳞癌淋巴结转移组VEGF、P53蛋白表达的平均FI高于非转移组(P＜0.05)。(4)经Pearson相关检验分析，非转移组与转移组HIF-1α与VEGF表达均呈正相关(r=0.715，0.883,P＜0.05)，HIF-1α与P53表达亦呈正相关(r=0.725,0.852，P＜0.05)。(5)喉鳞癌淋巴结转移组原发灶与其转移淋巴结VEGF、P53蛋白表达平均FI转移淋巴结均高于原发灶，P＜0.05。(6)在喉鳞癌淋巴结转移组原发灶与其转移淋巴结中HIF-1α与VEGF表达均呈正相关(r=0.715,0.686,P＜0.05)，HIF-1α与P53表达亦呈正相关(r=0.755,0.823,P＜0.05)。
1.3RT-PCR检测HIF-1αmRNA在喉癌组织中的表达，在63例喉鳞状细胞癌中有46例HIF-1αmRNA呈阳性表达，在487bp处可见清晰条带，在20例正常喉粘膜组织中16例HIF-1αmRNA呈阳性表达，二者在统计学无显著差异。
2低氧对喉鳞癌细胞系Hep-2HIF-1α及其相关基因表达的影响
2.1免疫细胞化学SP法检测低氧组Hep2细胞胞浆中呈阳性表达，且随着缺氧时间延长表达增强。
2.2缺氧12h组、缺氧24h组及对照组HIF-1α免疫荧光指数分别为：1.69±1.21，5.83±1.28，0.22±0.07；上述三组P53免疫荧光指数分别为：2.75±0.02，5.27±0.07，1.15±0.01；上述三组VEGF免疫荧光指数分别为：4.85±0.03，10.37±0.2，2.15±0.06；经F检验，3组间的差异均有统计学意义，P＜0.05。
2.3流式细胞仪测定缺氧组HIF-1α与P53表达呈明显正相关性(r=0.715,P＜0.05)，HIF-1α与VEGF表达呈明显正相关性(r=0.925，P＜0.05)。
结论：
1应用免疫组化技术、流式细胞技术、RT-PCR技术对人喉鳞癌63例标本分别从HIF-1α蛋白表达水平定性、定位及定量、HIF-1α基因水平表达等不同侧面研究表明，HIF-1α与喉鳞癌转移、临床分期及病理分级密切相关，并在肿瘤血管生成以及筛选抗凋亡细胞中与VEGF、P53等相关调控因子协同作用促进了肿瘤发展的恶性进程。尤其是肿瘤乏氧情况下，P53基因突变或缺失时可增加癌细胞对抗癌药诱导的凋亡的耐受力，因此推测乏氧以及乏氧造成的P53基因突变率增加是造成喉鳞癌细胞治疗抵抗的重要影响因素，这—研究结果为进一步体外实验探讨喉鳞癌治疗抵抗机制奠定了重要基础。
2体外低氧实验结果表明，缺氧导致人喉鳞癌Hep-2细胞G0/G1期阻滞，HIF-1α、P53在缺氧导致的Hep-2细胞G0/G1期阻滞中可能起重要作用；顺铂主要作用于增殖期细胞，低氧使Hep2细胞产生化疗抵抗，其中HIF-1α蛋白表达水平升高以及低氧造成的G0/G1期细胞周期阻滞可能在顺铂诱导的人喉鳞癌细胞凋亡中发挥重要的抗凋亡作用。该实验结果为进一步探讨以低氧为靶提高喉鳞癌化疗治疗效果提供了实验依据。
低氧诱导因子-1α;喉鳞癌;免疫组织化学;化疗抵抗;化疗增敏;体外低氧实验
河北医科大学
博士
外科学
李晓明
2006
中文
R730.231.1;R739.65
123
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）