粘蛋白MUC1在乳腺癌免疫诊断和免疫治疗中的作用研究
乳腺癌(breastcancer)是女性最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年有120万妇女发生乳腺癌。北美和欧洲等西方国家是乳腺癌高发区，据统计，美国妇女平均每9人中将有1人最终患乳腺癌。从20世纪70年代起，原为乳腺癌低发区的亚洲国家发病率逐年上升，在我国，特别是在北京、上海等发达城区己成为危害妇女健康的主要恶性肿瘤。随着分子生物学的飞速发展及各种高新技术的不断涌现，乳腺癌基础研究取得了长足的进步。乳腺癌的早期发现是提高乳腺癌生存率和降低转移复发率的重要手段，而乳腺癌的治疗也从单一的手术治疗发展为结合手术、化疗、放疗、内分泌治疗及免疫治疗、基因治疗的综合治疗体系，进一步提高了乳腺癌的治愈率和生存率。在乳腺癌的基础研究新进展中，筛选特异性肿瘤标志物成为重要的一个方面。筛选特异性肿瘤标志(tumormarker)可用于肿瘤的早期发现与疗效评价，并且可以针对特异性肿瘤标志物研制特异性抗体，携带化学药物、生物毒素、放射性核素示踪迹等“生物导弹”定向杀伤肿瘤细胞，还可以研制免疫瘤苗开展对于肿瘤的生物治疗。
近年研究发现的粘蛋白家族成为之一，MUC1在乳腺癌组织中的异常表达和糖基化，为免疫学诊断与生物治疗提供了新的靶点。粘蛋白1(MUC1)又称多形上皮粘蛋白(polymorphicepithelialmucin，PEM)，是一种主要分布于腺上皮细胞的跨膜糖蛋白，最先由Shimiza于1982年从人的乳汁中分离得到。2000年6月，人类白细胞分化抗原工作组将MUC1归类于白细胞分化抗原(clusterofdifferentiation，CD)，命名为CD227。研究证明,MUC1在肿瘤细胞上的表达与正常细胞是不同的，主要体现在以下几个方面：(1)MUC1在肿瘤细胞表面的表达量较正常细胞显著升高；(2)MUC1在正常细胞上呈极性分布，集中位于腺上皮细胞的腺腔面；而在肿瘤细胞上MUC1却呈失极性，均匀地分布于细胞的表面；(3)MUC1在肿瘤细胞与正常细胞中的糖基化有不同的格局，使得MUC1核心序列表位暴露，刺激机体产生免疫应答。由于MUC1在肿瘤细胞上表达的量和质都发生了变化，因此MUC1成为一种重要的肿瘤标志物，在乳腺癌诊断和治疗中具有潜在的临床应用价值。
由于MUC1作为一个肿瘤相关抗原能够有效的诱导机体产生肿瘤免疫应答，因此NUC1一直是研究抗肿瘤免疫的一个热门话题。继上世纪80年代成功制备了针对MUC1单克隆抗体后，以单克隆抗体为载体，对乳腺癌的抗体治疗研究方兴未艾。乳腺癌的特异性主动免疫治疗的一个重要的突破性进展是单克隆抗体herceptin的研究和应用。而另一个进展是双特异性抗体介导效应细胞的抗肿瘤作用的研究，已成为近年来肿瘤新型免疫治疗的主要研究方向之一。
本研究分以下三个部分：
第一部分：粘蛋白MUC1在乳腺癌诊断、预后及侵袭转移中的作用机制研究
目的：a.检测粘蛋白MUC1在乳腺癌组织及乳腺良性组织中的表达，探讨MUC1作为一种新型乳腺癌肿瘤标志物的可能性；b.检测粘蛋白MUC1在乳腺癌组织中的表达，并与乳腺癌组织中ER、PR、c-erbB2及乳腺癌患者临床病理学指标及预后指标进行相关性分析，探讨MUC1作为乳腺癌临床预后指标的意义；c.检测粘蛋白MUC1在乳腺癌组织中的表达，并同时检测黏附分子E-cadherin的表达，探讨MUC1在乳腺癌侵袭、转移中的作用机制。
方法：应用免疫组织化学SP法检测5例乳腺纤维腺瘤标本、5例正常乳腺标本和40例手术切除的乳腺癌标本原发病灶中MUC1、ER、PR、C-erbB-2和E-cadherin的表达情况。依据乳腺癌的侵袭性、临床分期、癌细胞分化程度、腋窝淋巴结转移情况、肿瘤直径、患者的月经状态对40例乳腺癌组织标本进行分组，通过光学显微镜观察免疫组织化学染色情况，并应用统计学方法对结果进行分析。
结果：a.乳腺良性病变组织中可见MUC1阳性表达，阳性表达主要在腺腔上皮游离缘；而乳腺癌组织中的MUC1高表达，阳性表达为深棕色及棕黄色颗粒，主要表达位于胞质内。正常乳腺上皮细胞可见MUC1弱阳性表达。MUC1在乳腺癌组织的高表达与乳腺良性病变组织及乳腺正常组织的低表达之间存在显著性差异(p＜0.05)；b.粘蛋白MUC1在乳腺癌的表达与乳腺癌的类型、分期、肿瘤大小、月经状态均无显著相关性(p＞0.05)；与组织学分级、有无淋巴结转移及ER、PR有相关性(p＜0.05)；MUC1表达与c-erbB2表达有相关性且MUC1在乳腺癌组织中的表达率明显高于c-erbB2表达(p＜0.05)；c.乳腺癌原发肿瘤组织中E-cadherin表达缺失率与正常乳腺组织之间的差异非常显著(P＜0.001)。E-cadherin表达强度在乳腺癌Ⅰ～Ⅲ级之间及有无淋巴结转移的原发肿瘤之间具有显著性差异(P＜0.05)；而MUC1的高表达与E-cadherin表达缺失有显著相关性(P＜0.05)。
结论：a.MUC1在乳腺癌组织中显著高表达，在乳腺癌诊断中有一定意义；b.MUC1与乳腺癌的临床预后有一定相关性；c.研究表明MUC1可使E钙粘蛋白(E-cadherin)表达下调，实验证实MUC1可能因此而有利于肿瘤的侵袭和转移，并由此影响乳腺癌病人的预后。总之，作为新型的肿瘤标志物MUC1在乳腺癌的免疫诊断中具有重要意义。
第二部分：粘蛋白MUC1在乳腺癌患者外周血微转移检测中的意义
目的：以粘蛋白MUC1和细胞角蛋白CK7为基因标志物检测乳腺癌患者外周血中播散的肿瘤细胞，探讨粘蛋白MUC1作为肿瘤基因标志物在乳腺癌微转移诊断中的意义。
方法：采用RT-PCR法检测乳腺癌患者外周血中有核细胞的MUC1和CK7mRNA表达。
结果：a.检测15例正常人外周血MUC1、CK7mRNA表达，结果无假阳性；将乳腺癌细胞系MCF-7分别以1：105、1：106与正常外周血有核细胞混合，检测MUC1、CK7表达，结果无假阴性。b.检测35例乳腺癌患者外周血，以MUC1为标志物，外周血中肿瘤细胞检出率为30.3％(11/35)；以CK7为标志物，外周血中肿瘤细胞检出率为35.0％(12/35)；c.35例患者中有4例MUC1、CK7均表达阳性，有7例仅MUC1表达阳性，有8例仅CK7表达阳性，两种肿瘤标志物表达患者有交叉但不重叠。d.乳腺癌患者外周血MUC1阳性率在患者不同年龄、肿瘤大小、临床分期、组织学分级、ER和PR状态的各组间差异无显著性(p＞0.05)；淋巴结转移阳性病例外周血肿瘤细胞检出率(36.3％)明显高于淋巴结转移阴性组(19.4％)虽然统计学差异不具有显著性，但提示淋巴结转移阳性患者肿瘤细胞血行播散的危险性有增加趋势。
结论：以MUC1、CK7为基因标志物，采用RT-PCR方法，对于检测乳腺癌患者外周血中的微转移诊断，及乳腺癌病人预后的判断，具有重要意义。可以为制定治疗方案、评价治疗效果，以及外周血干细胞移植联合大剂量化疗适应症的筛选提供重要依据；另外多种肿瘤基因标志物联合检测，结果优于单一标志物检测。
第三部分：MUC1/CD3双特异性抗体介导LAK细胞对乳腺癌细胞杀伤的体外实验研究
目的：应用化学耦连法制备MUC1/CD3双特异性抗体，并通过体外实验研究，探讨双特异性抗体(BsAb)介导下LAK细胞对过度表达MUC1基因的乳腺癌MCF-7细胞株的杀伤效果，评价MUC1在乳腺癌免疫治疗中的应用价值。
方法：化学耦连法制备既抗乳腺癌MCF-7细胞表面MUC1抗原，又抗T细胞表面CD3抗原的双特异性抗体(简称双抗，BSAb)，进行体外实验研究，观察双抗介导的外周血淋巴细胞与靶细胞的结合，MTT法检测双抗介导的外周血淋巴细胞对靶细胞MCF-7的杀伤效应。
结果：a.LAK细胞表型测定结果：本试验诱导的主要是CD3表型的LAK细胞占85％。b.双抗对LAK细胞与MCF-7乳腺癌细胞结合率的影响：BASb组介导的MCF-7细胞和LAK细胞的结合率，与a-CD3组、a-MUC1组、a-CD3+a-MUC1组及Media组比较有显著性差异(p＜0.05)。表明双特异性抗体能显著增加LAK细胞与MCF-7细胞的结合率。c.双抗对LAK细胞对乳腺癌MCF-7细胞的体外细胞毒性影响：当效靶比为20：1时，加入不同浓度的BSAb后，细胞毒性随抗体浓度递增而逐渐上升，抗体浓度为40μg/ml时，细胞毒性是53.9％，显著高于其它组(p＜0.05)。当BSAb浓度为40μg/ml时，不同效靶比LAK细胞对MCF-7细胞的细胞毒作用随效靶比增大而增强。
结论：a.MUC1/CD3双特异性抗体能显著提高LAK细胞与乳腺癌MCF-7细胞的结合率；b.MUC1/CD3双特异性抗体能够显著提高LAK细胞对乳腺癌细胞的杀伤效应。
总结
1MUC1在乳腺癌组织中的高表达，使其有可能成为乳腺癌诊断的敏感性指标。
2MUC1与乳腺癌临床预后指标问有一定的相关性。
3MUC1可使E-cadherin表达下调，可能因此而有利于肿瘤的侵袭和转移，从而影响乳腺癌病人的预后。
4以MUC1为基因标志物，采用RT-PCR方法检测乳腺癌患者外周血中的微转移可能是乳腺癌有意义的预后指标，可以为治疗方案的选择、治疗疗效的评价，及外周血干细胞移植联合大剂量化疗适应症的确定提供重要依据。
乳腺癌;粘蛋白MUC1;微转移;双特异性抗体;免疫治疗;免疫诊断
河北医科大学
博士
外科学
蔡建辉
2006
中文
R730.2;R737.9
77
2007-08-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）