花椰菜胞质不育及育性保持相关基因的克隆与分析研究
花椰菜属十字花科，芸薹属，是一种重要的蔬菜类作物。利用花椰菜细胞质雄性不育系及相应的保持系、优良父本所进行的杂交优势利用，已广泛用于花椰菜高品质杂交种的生产。但在实际育种中，可利用的花椰菜细胞质雄性不育资源十分有限，而选育或创建新型花椰菜细胞质雄性不育系的理论基础尚不健全，这在很大程度上阻碍了花椰菜杂交优势的利用。为此，开展花椰菜细胞质雄性不育相关分子机制的研究，不但可为利用花椰菜细胞质雄性不育系进行杂交制种提供理论支持，而且也可在深层次上认识花椰菜细胞内核质互作的机理。
本论文以花椰菜细胞质雄性不育系和相应的保持系为材料开展了如下方面的研究：
1.基于同源序列的候选基因克隆法，选定7个最有可能与花椰菜细胞质雄性不育相关的基因，分别为atpa、atp6、atp9、coxⅠ、coxⅡ、orfB和orf224，最终确定orfB与其雄性不育密切相关。对orfB的转录分析表明，orfB只在细胞质雄性不育花椰菜中转录。序列分析表明，orfB与Ogura型胞质不育萝卜的雄性不育相关基因orf138高度同源。进一步分析，利用报道的orf128位点处的序列设计引物，PCR扩增，在花椰菜细胞质雄性不育系中克隆到包含orfB全长的一段序列。该序列结构与Ogura型胞质不育萝卜orf138位点处的一致，含有三个可编码区：trnfM、orf138和orf158。转录分析显示其中的orf138和orf158与Ogura型胞质不育萝卜中的一样可共转录。但对这些转录产物的RNA编辑分析发现，在细胞质雄性不育花椰菜中orfB位点处的RNA编辑，可能有着特殊的编辑机制，并且发现有个别位点的RNA编辑在细胞质雄性不育花椰菜和Ogura型胞质不育萝卜中有所不同。因此，认为尽管实验所用花椰菜不育系也为Ogura型胞质不育，但二者雄性不育的具体形成机制有所不同。
2.采用同源序列的候选基因克隆方法，克隆了花椰菜两系内的线粒体基因nad3/rps12。分析发现该基因位点处的基因结构在两系中存在差异，但基因在转录水平未表现出不同。进一步对该基因在两系中的RNA编辑情况进行了深入研究。采用cDNA-SSCP结合测序技术共检测到12种不同的RNA编辑模式，20个RNA编辑位点。其中特异出现在细胞质雄性不育系中的RNA编辑模式有9种，在保持系中的有3种。RNA编辑位点在细胞质雄性不育系中主要以C到U的不完全编辑为主，而在保持系中完全编辑和提前编辑的位点占优势。结果表明基因nad3/rps12的RNA编辑在花椰菜两系中存在明显不同，推测其与花椰菜细胞质雄性不育的发生有关。
3.对花椰菜细胞质雄性不育系和保持系的基因组进行了RAPD和ISSR分析。筛选了406条RAPD引物，检测到了2160条清晰可辨的条带，而其中只有引物S2121在保持系中扩增出一条约900bp的特异带。根据测序结果设计特异引物将其转化成特异PCR标记，命名为S2121900。随后又筛选了30条ISSR引物，在两系中共扩增出306条清晰可辨的条带，只有引物ISSR3在两系的扩增中表现出多态性，在保持系可检测到一条约1100bp的特异条带，命名为ISSR31100。为进一步验证S2121900和ISSR31100的特异性，又对其分别进行了Southern斑点杂交分析，单株及已知育性花椰菜材料检测等实验。结果进一步证实S2121900和ISSR31100确为花椰菜保持所特有。序列分析表明，S2121900与甘蓝型油菜及拟南芥线粒体基因相应区段高度一致，并且序列中存在多个潜在的RNA编辑位点。推测S2121900极有可能来源于花椰菜线粒体基因组，且具有编码功能。初步的转录分析也证实S2121900在保持系中表现为特异性转录，可检测到一条约350bp的特异转录物。ISSR31100也与报道的一些线粒体基因序列具较高同源性，推测其也源于花椰菜保持系线粒体基因组，但还有待于进一步验证。
4.采用DDRT-PCR技术对花椰菜细胞质雄性不育系和保持系内基因的差异表达情况进行分析。选用了3条锚定引物，15条随机引物进行组合，最终共获得1122条大小在1000-50bp的带。经反向Northern杂交验证，其中的4条在两系中表现为差异表达，分别命名为NKC-6205、NKC-6383、NKC-68307和NKC-68352，其中NKC-6205和NKC-6383在不育系中特异表达，NKC-68307和NKC-68352在保持系中特异表达。分析表明4个差异序列均未见报道。其中NKC-6205、NKC-68307至今尚未发现与之相似的序列，有待于进一步研究；NKC-6383、NKC-68352与报道的拟南芥、菠菜、玉米、烟草等的叶绿体基因的一些片段具较高相似性，推测NKC-6383、NKC-68352可能来源于花椰菜叶绿体基因组。
5.利用在花椰菜细胞质雄性不育系中获得的特异扩增orfB，转化成细胞质雄性不育花椰菜特异分子标记，命名为orfB300及对两系RAPD和ISSR分析获得的花椰菜保持系特异分子标记S2121900和ISSR31100，对收集到的花椰菜材料进行筛查。结果显示，在所有细胞质雄性不育花椰菜中都可检测到orfB300，而在所有可育花椰菜中都可检测到S2121900和ISSR31100。证明目前实验所用的花椰菜细胞质雄性不育系都具有同样的胞质类型，而检测到的可育花椰菜都可能作为优良父本配制花椰菜杂种。同时，利用orfB300对以Ogura型胞质不育青花菜为不育源，经回交转育获得的6个球茎甘蓝细胞质雄性不育系的胞质类型进行了鉴定，在分子水平确定转育成功。
6.对辣椒细胞质雄性不育系、恢复系及F1代进行RAPD分析，共筛选了336条RAPD引物，其中引物S418在恢复系中呈现特异性扩增，得到一条约3000bp的特异片段。回扩得到两条片段，测序表明大小分别为1515bp和1162bp。荧光原位杂交证实1515bp片段为恢复系特有，命名为S4181515；序列分析表明S4181515为一新发现的序列，Blastn序列比对同源性小于40％，tBlastx比对发现该序列与水稻2、4、7、10号染色体的几个BAC克隆上的序列高度同源，推测可能与其具有相似的编码功能。该研究为下一步克隆辣椒育性恢复基因奠定了基础。根据测序结果设计特异引物，将S4181515转化成特异PCR标记，证明其可用于在早期对辣椒恢复系进行初筛。
花椰菜;细胞质雄性不育;同源序列克隆;十字花科;芸薹属
南开大学
博士
遗传学
宋文芹
2006
中文
Q949.748.3;Q78
200
2007-07-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）