肝细胞癌中CDKN2A基因甲基化及在临床上应用的研究
肿瘤的发生是遗传因素与环境因素共同作用的结果，其中抑癌基因的失活是细胞发生癌变的重要机制。基因的失活可以通过突变、插入和删除等遗传学途径，也可以通过基因甲基化、印迹缺失或染色体组构等表观遗传学途径。近十年来的大量研究不仅已经证实了DNA甲基化在肿瘤细胞的转化、增殖、侵润及转移等各个环节中的重要作用，同时，这些研究也表明DNA甲基化的分析有望用于肿瘤的早期诊断、肿瘤分型、疗效评估以及药物开发等临床领域。本论文的主要研究目的就是要尝试将肿瘤表观遗传学研究的基础理论和分析技术应用于医学临床，并对应用过程中可能遇到的问题提出对策。
MSP是检测特定基因甲基化状态最常用的技术，它的引物设计涉及基因结构的确定、侧翼序列的获得、CpG岛的搜寻以及原基因序列的转换和比对等诸多步骤，一般的PCR引物辅助设计工具无法满足这些特殊要求。本文充分利用当前主要基因组数据库、图谱浏览器和序列分析工具，结合自行编制的序列转换程序来对引物进行设计与评估，从而建立了一种基于生物信息学的MSP引物设计方法，在实际应用中已证明了这种方法的可行性。
DNA甲基化在临床领域一个重要的应用就是作为一种生物标志物，用于肿瘤的分子诊断和早期检测。目前已有研究证实了肝细胞癌病人血液DNA中CDKN2A基因的甲基化与肝癌的发生之间存在密切联系，因此对循环DNA甲基化状态的检测有望为肝癌的早期诊断提供一种非侵入性的诊断方法。但是，要作为一种能够实际应用于临床检验的生物标志物，除应具有较高的灵敏度外，还要有很好的特异性。通过对10例健康人、10例肝炎、10例肝硬化及8例肝癌病例血液DNA中CDKN2A基因甲基化状态的检测，发现37.5％(3/8)的肝癌病人该基因的甲基化呈阳性，而且统计学分析表明CDKN2A的甲基化在肝癌与非肝癌人群中存在显著性差异；但同时也发现在肝硬化人群中有20％(2/10)的病例血液中CDKN2A有甲基化发生。这一结果提示，CDKN2A的甲基化并非完全特异性地发生于肝癌病人中，在基因的甲基化作为标志物进行肝癌早期诊断时还必须结合其他病理学诊断结果以避免误诊。
将甲基化标志物应用于临床诊断的另一个要求是较高的准确度，但MSP在实际检测中往往会由于DNA修饰不完全、模板降解程度各不相同等因素而造成一些假阳性或假阴性结果。在本研究中，针对这个缺点设计了一种新的将亚硫酸氢化-测序PCR与甲基化特异性PCR相结合的巢式BS-MSP技术，与普通巢式或半巢式MSP技术相比，它的最大特点在于其外侧引物使用一对BS引物而不是MSP引物。这一设计使得BS-MSP除具体普通巢式PCR的高灵敏度和高特异性外，还可以在第一次PCR中对模板的质量进行评估以避免进一步的假性结果产物，而且，其产物还可同时用于甲基化与非甲基化特异性扩增。
在我国及亚洲其他地区，肝癌的发生常与HBV感染相关。根据这一特点，本文利用BS-MSP技术对40例HBV相关肝癌中CDKN2A基因的甲基化情况进行了检测。结果除3例标本因模板质量而无法检测外，其余有78％(29/37)的病例在癌组织有甲基化发生。目前国内尚无对HBV相关肝癌CDKN2A基因甲基化的研究，但这一结果与日本和韩国这两个亚洲国家报道甲基化发生率(分别为72.7％和83.3％)比较接近。同时，通过与其他小组的研究结果相比较可以发现，肝癌组织中HBV的存在可能会导致基因甲基化的发生率要高于那些没有病毒感染背景的肝癌。
对术后切缘部位的检查不仅是对手术疗效进行评估的必要手段，而具对于病人的预后也有一定意义；但是常规的组织病理学方法并不能及时有效地发现那些微小的癌前病灶或新发肿瘤，因此目前已有很多分子生物学的方法开始用于切缘检查。本文首次将基因甲基化检测的技术应用于肝癌的切缘分析，以研究切缘部位在表观遗传学上的异常改变。在20例肝癌手术切除的肝组织中，有35％(7/20)在切缘上存在CDKN2A基因的甲基化。这个结果表明，在相当一部分组织病理学检查为阴性的切缘上，通过灵敏度较高的分子生物学技术还是能够检测到基因组在表观遗传学上的异常改变。基于基因甲基化的分子切缘分析对于术后肝癌病人的预后可能具有一定的意义，但切缘处基因异常甲基化的发生是否最终会导致成新生肿瘤，并导致肝癌术后的局部复发，这还需要通过更长时间的随访并获得相关病理资料后才能进行研究。
在表观遗传学的基础理论方面，对于在甲基化向持家基因启动子区的延伸过程有两种观点，即“渐进式”和“全或无”两种方式。前者认为基因的甲基化是随着细胞的增殖和传代逐渐向原本受到保护区域扩散，这一过程是个甲基化与去甲基化同时发生的动态过程；而后者则认为甲基化的发生是个一过性的事件，它在很短的时间内即可覆盖整个CpG岛。本文通过COBRA、MS-SSCP及MSP产物直接测序等方法，对7例肝细胞癌的癌组织、癌旁组织和切缘组织中CDKN2A基因甲基化模式和水平进行了分析和比较，结果发现切缘处基因的甲基化程度均为部分甲基化，这与癌组织中的完全或高度甲基化模式有很大不同。这一结果提示肝癌中CDKN2A基因的体内甲基化过程是一种“渐进式”方式，这与其他研究者在胃癌中得出的“全或无”方式完全不同。
肝细胞癌;抑癌基因;基因失活;DNA甲基化;CDKN2A基因
南开大学
博士
遗传学
宋文芹
2006
中文
R735.7
136
2007-07-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）