在大肠杆菌中高表达具有生物活性的人神经生长因子
神经生长因子(nervegrowthfactor，NGF)是神经系统最重要的生物活性分子之一，对调节神经元的生长、发育、分化、存活及损伤神经的再生修复具有重要作用，并且参与维系神经、免疫和内分泌系统之间的平衡。
NGF在人体组织中含量极微，已有报导从胎盘中纯化hNGF，但其组织来源极其有限，成本高产量低，不能满足对hNGF的需求，所以利用基因工程方法获得有生物学活性的hNGF制品，对其基础理论研究和临床应用具有深远的意义。
本研究利用原核(大肠杆菌)表达系统，成功表达了人β神经生长因子的成熟肽，表达产物经SDS-PAGE，Western-blot分析，分子量为16.9kD，与预期值相符，同时具有免疫学活性；经鸡胚背根神经节(DRG)感觉神经元鉴定，表达的重组NGF具有良好的生物学活性。我们的研究为在原核表达系统中高表达NGF、并且快速获得较纯的具有生物学活性的NGF提供了简便的途径，也为NGF的性质研究，以及NGF的临床应用研究打下了基础。主要研究内容及结果如下：
1.β-NGF的基因克隆。从人胎盘组织中提取总DNA，经PCR扩增编码人β神经生长因子(β-NGF)成熟肽的基因，并克隆到大肠杆菌表达载体pET15b中，将重组质粒pET15b-NGF转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，测序结果与Ullrich等报道的人NGF基因序列完全一致。
2.NGF成熟肽蛋白的诱导表达。用1mMIPTG诱导转化的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达，表达后的全菌蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，目的带分子量大小约为16.9kD，与预期值相符，表达量可达全菌总蛋白量的25％。
3.重组NGF的纯化和复性。表达的目的蛋白绝大部分存在于包涵体沉淀中，对表达后的菌体进行超声裂解，释放包涵体后，对其进行初步纯化最后溶于8M尿素中，再用His-tag柱对其进行亲和层析纯化，经SDS-PAGE检测，纯化后得到了不含其他杂蛋白的单一NGF条带，蛋白纯度可达90％以上，从每升表达菌液中可以得到4.56mgNGF。然后将过柱纯化后的NGF进行透析复性。
4.重组NGF的免疫学活性及其生物学活性检测。表达产物的Western印迹鉴定结果显示：重组人神经生长因子能与兔抗人β-NGF的多克隆抗体发生特异性结合反应，在16.9kD处出现单一的条带，表明诱导表达的重组NGF具有免疫学活性。鸡胚背根神经节感觉神经元鉴定试验表明，本实验表达的重组NGF具有良好的生物学活性。
β神经生长因子;大肠杆菌;基因克隆;蛋白表达;免疫学活性
南开大学
硕士
遗传学
俞新大
2006
中文
Q421;R394
59
2007-07-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）