ATM对AT细胞端粒酶活性、hTERT表达影响研究
目的：利用基因转染技术构建ATM稳定表达的ATM+．AT细胞株，观察外源性ATM蛋白对端粒酶活性、端粒酶逆转录酶(hTERT)表达的影响；研究电离辐射后剂量因素、时间因素对端粒酶活性、hTERT表达的影响；比较内、外源性ATM对端粒酶活性、hTERT表达影响的差异性；探讨hTERT表达对端粒酶活性的调控作用。
方法：(1)利用电穿孔技术，将含有ATM基因cDNA的真核表达载体PEBS7．YZ5转染到AT细胞中，用潮霉素筛选以获得稳定表达细胞株，RT-PCR检测ATMmRNA的转录，Westemblot检测ATM蛋白的表达；(2)以源于正常人皮肤的成纤维细胞系GM细胞(GM0639)为对照，应用端粒重复序列扩增技术(TRAP)与高效液相色谱技术(HPLC)，定量分析细胞经0、1、3、5Gy60CoY射线照射后，AT、空载体AT、ATM+．AT和GM细胞端粒酶活性的变化；(3)以GM细胞为对照，应用TRAP和HPLC技术，定量分析细胞经3Gy60COγ射线照射后继续培养2、24、48、72h，AT、空载体AT、ATM+-AT和GM细胞端粒酶活性的变化；(4)以GM细胞为对照，应用IT-PCR和Westemblot技术，观察细胞经0、1、3、5Gy60CoY射线照射后，AT、空载体AT、ATM+．AT和GM细胞hTEIRTmRNA和蛋白表达的变化；(5)以GM细胞为对照，应用RT-PCR和Westemblot技术，观察细胞经3Gy60Co丫射线照射后继续培养2、24、48、72h，AT、空载体AT、ATM+-AT和GM细胞hTE盯mRNA和蛋白表达的变化。
结果：(1)PEBS7．YZ5成功转染AT细胞，潮霉素筛选后获得稳定表达ATM的ATM+．AT细胞株，RT-PCR检测到ATM基因的转录，Westemb10t检测到ATM蛋白的表达；(2)未照射时，除GM细胞外，AT、空载体AT、ATM+-AT细胞均有端粒酶活性表达，但ATM+-AT细胞的端粒酶活性明显低于AT和空载体AT细胞(P<O．01)，而后二者无明显差异(P>0．05)；不同剂量电离辐射照射后，AT、空载体AT、ATM+-AT和GM细胞的端粒酶活性均呈剂量依赖性增强，且在相同剂量点，ATM+-AT细胞的端粒酶活性高于GM细胞(P<O．01)，但低于AT和空载体AT细胞(P<O．01)，而后二者无明显差异(P>0．05)；(3)同一剂量电离辐射照射后细胞继续培养，AT、空载体AT、ATM+-AT和GM细胞的端粒酶活性均呈时间依赖性增强，且在相同时间点，ATM+-AT细胞的端粒酶活性高于GM细胞(P<0．01)，但低于AT和空载体AT细胞(P<0．01)，而后二者无明显差异(P>0．05)；(4)未照射时，除GM细胞外，AT、空载体AT、ATM+．AT细胞均有hTERTmRNA和蛋白表达，但ATM+-AT细胞的hTERTmRNA和蛋白表达明显低于AT和空载体AT细胞(P<0．01)，而后二者无明显差异(P>0．05)；不同剂量电离辐射照射后，AT、空载体AT、ATM+-AT和GM细胞的hTERTmRNA和蛋白表达均呈剂量依赖性增强，且在相同剂量点，ATM+．AT细胞的hTE盯mRNA和蛋白表达高于GM细胞(P<0．01)，但低于AT和空载体AT细胞(P<O．01)，而后二者无明显差异(P>0．05)；(5)同一剂量电离辐射照射后细胞继续培养，AT、空载体AT、ATM+-AT和GM细胞的hTERTmRNA和蛋白表达均呈时间依赖性增强，且在相同时间点，ATM+．AT细胞的hTERTmRNA和蛋白表达高于GM细胞(P<0．01)，但低于AT和空载体AT细胞(P<O．01)，而后二者无明显差异(P>O．05)；(6)hTE盯的表达与端粒酶活性一致。
结论：(1)在PEBS7．YZ5稳定转染的ATM+．AT细胞株中，外源性ATMmRNA和蛋白稳定表达；(2)电离辐射可诱导细胞端粒酶活性、hTERT表达；(3)电离辐射照射后，细胞端粒酶活性水平、hTE盯表达量呈剂量依赖性与时间依赖性增加；(4)ATM可下调AT细胞端粒酶活性水平、hTERT表达量；(5)外源性ATM对端粒酶活性、hTERT表达的调控作用低于内源性ATM；(6)hTERT的表达是端粒酶激活的关键因素。
AT细胞;ATM;端粒酶;端粒酶逆转录酶;电离辐射
苏州大学
硕士
放射医学
曹建平;何玲
2006
中文
R818.053
51
2007-07-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）