SHG44细胞辐射抗性与Akt相关性的研究
目的：本课题通过观察SHG44细胞经不同剂量60Coγ线照射产生的染色体损伤；研究不同浓度WORT与6~C07线照射对SHG44细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响；以及活性Akt转染SHG44细胞观察照射后细胞增殖和细胞凋亡的变化，探讨SHG44细胞辐射抗性与AKT的相关性。
方法：(1)应用胞浆分裂阻滞微核法观察SHG44细胞微核率(MNF)、微核细胞率(MNCF)的变化：(2)应用MTT法、克隆形成法研究SHG44细胞增殖活性的变化：(3)应用乙醇固定后染色的流式细胞术观察细胞周期分布的变化：(4)应用吖啶橙(AO)／溴化乙啶(EB)染色后激光共聚焦显微镜(LGSM)法观察细胞凋亡形态特征。(5)电穿孔技术将活性Akt转染SHG44细胞，RT-PCR鉴定外源AktmRNA表达。
结果：(1)SHG44细胞MNF和MNCF均随照射剂量增加而升高；在2Gy剂量范围出现“肩区”，3、4Gy剂量照射后MNF和MNCF提高更明显；(2)SHG44细胞存活率在1．00×104～5．00×10'Tmol／L范围随WORT浓度升高而降低，5．00×10-7～5．00×10'6mol／L范围随WORT浓度升高变化不大，1．50×i0-5～3．00×10'Smol／L浓度范围又随WORT浓度升高而降低。细胞增殖能力检测结果表明SHG44受不同剂量60CoY线照射后细胞存活率随照射剂量升高而降低；与WORT有交互作用，WORT阻滞AKT活性后照射组SHG44细胞存活率均低于单独照射组。细胞周期检测结果表明单独WORT处理后G2／M、S期细胞比例增加，而G0/Gl期细胞比例降低，凋亡细胞比例为1．O％；单独10Gy6~CoY线照射后G0/Gl、S期细胞比例无明显变化，而G2／M期细胞比例降低，凋亡细胞比例为9．3％。WORT阻滞AKT活性后照射组SHG44细胞Go／G~期细胞比例明显增加，而s期、G2／M细胞比例降低，凋亡比例明显增加到23．4％。AO／EB染色结果显示WORT诱导SHG-44细胞凋亡以细胞膜变化为主，呈浓度依赖性；辐射诱导细胞凋亡以核形态变化为主，照射后细胞核形态不规则并出现核碎裂、微核或凋亡小体样碎片；WORT阻滞AKT活性后照射组细胞核、膜的变化更显著。(3)细胞生长密度随电击电压升高而下降，SHG44细胞在780V电压下约存活50％，在此条件下pEGFP-cl的转染效率大于80％；GFP在细胞浆内表达并在转染后48．72h荧光强度较强。活性PKB(pCMV5．HA-m／p-PKBQ)、失活PKBD(pCMV5．HA-PKBQ．DD(T308D／S473D))成功转染SHG44细胞，RT-PCR检测到外源AktmRNA表达；PKB转染SHG44细胞后促生长率为6．06％(与未照射的对照组比较)；对照组(未转染)细胞经6Gy照射后抑制率为7．07％，而PKB转染组照射后细胞增殖率无明显变化。6~CoY线照射使对照组SHG44细胞出现明显的凋亡，以细胞核形态变化为特征；PKB-照射组SHG44细胞形态完整，无明显凋亡；而PKBD-照射与对照一照射组相比凋亡更显著。
结论：(1)MNF和MNCF与照射剂量之间存在明显的剂量依赖关系，在2Gy剂量范围出现“肩区”，提示SHG44细胞存在亚致死损伤性修复，3、4Gy剂量照射后MNF和MNCF提高更明显，部分说明SHG44细胞有一定的辐射抗性。(2)WORT能抑制SHG44细胞增殖并与6~CoY线有交互作用，WORT阻滞AKT活性能降低SHG44的辐射抗性；WORT阻滞AKT活性后诱导细胞受照射后发生Gl期阻滞、细胞凋亡；间接证明WORT阻滞的AKT通路与SHG44细胞辐射抗性有关。(3)室温、4mm电击宽度下，106／ml细胞密度的SHG44细胞在150mOsm／L(Hypo：Iso=7：3)、780V、60p．s条件下电击1次转染4．7kb大小的质粒时，转染效率大于80％；Akt转染能促进SHG44细胞增殖、抵抗辐射诱导的细胞凋亡，从而证明AKT与SHG44细胞辐射抗性存在一定的相关性。
胶质瘤;辐射抗性;细胞凋亡;细胞周期;染色体损伤;照射剂量
苏州大学
硕士
放射医学
刘芬菊
2006
中文
R730.264;R730.55
50
2007-07-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）