短小芽孢杆菌组成型高效表达分泌系统的建立与应用
利用天然的或经过遗传改良的微生物进行植物病虫害的防治是目前国际上较为活跃的研究领域，尤其是利用植物本身根系和叶围正常存在的微生物进行外源抗病虫害基因的转化，可使外源基因产物持续作用于植物表面，赋予植物抗病虫害的能力，避免或减少因使用化学农药对环境造成的污染。芽孢杆菌是重要的生防微生物，已有越来越多的研究表明，芽孢杆菌对植物的多种病原真菌、细菌和昆虫有抑制效果。本实验室从水稻叶片上分离出一株附生菌——短小芽孢杆菌DX01，它与水稻有良好的亲和性，经实验证明该菌具有天然拮抗某些真菌的特性，为了进一步将其定向改造成具有强抗真菌能力的工程菌，我们对该菌进行了一系列的研究工作。
采用PCR技术，亚克隆了来自短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)DX01菌株总基因组的启动子活性片断F1，并构建了大肠杆菌一短小芽孢杆菌穿梭表达载体pHY300-Flgfp，以缺失启动子的绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因，通过荧光激活细胞分检分析，检测了启动子F1在短小芽孢杆菌DX01中的转录活性和转录阶段。结果表明启动子n在短小芽孢杆菌DX01中有强的转录活性，是一个高效营养组成型启动子。
为了构建短小芽孢杆菌DX01的组成型表达分泌载体，以大肠杆菌B．内酰胺酶为报告蛋白，检测了枯草芽孢杆菌蛋白酶和果聚糖蔗糖酶信号肽以及短小芽孢杆菌DX01核糖核酸酶信号肽在短小芽孢杆菌DX01中驱动蛋白分泌的能力。研究结果表明这三个信号肽均能引导β-内酰胺酶从DX01细胞中分泌，但含有枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶信号肽的DX01能分泌比其他两个更多的B．内酰胺酶到细胞外；枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶和DX01核糖核酸酶的信号肽也能引导GFP从DX01细胞中分泌。
采用RT-PCR的方法，克隆了萝卜抗真菌蛋白1(Rs-AFPl)的cDNA全长，将去掉信号肽序列的Rs-afp1基因与终止密码子突变掉的绿色荧光蛋白(GFP)基因进行融合，并在其后加上T7终止子，连在枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶信号肽序列后面，构建成GFP-AFPl融合蛋白穿梭表达分泌载体pHY300-F1LgAFPl；将去掉信号肽的序列的Rs-afp1基因在其后加上盯终止子，连在枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶信号肽序列后面，构建成穿梭表达分泌载体pHY300-F1LAFPl。Western杂交证实融合蛋白GFP-AFPl在短小芽孢杆菌DX01中能够表达、分泌；工程菌DX01(pHY300-F1LAFPl)的抗真菌活性增强，说明萝卜抗真菌蛋白1在短小芽孢杆菌中能够有活性地表达和分泌。
短小芽孢杆菌;启动子功能;信号肽;表达分泌载体;抗真菌蛋白;病虫害防治
复旦大学
博士
遗传学
沈大棱
2006
中文
S476.12;Q939.124
55
2007-07-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）