rstB基因表达定位、功能验证及苜蓿的耐盐性遗传改良
rstB基因来源于费氏中华根瘤菌(SinorhizobiumFredii)耐盐突变株RT19。但该基因的耐盐机理不清楚，没有在植物上应用的研究报道。在NCBIGene-Bank中的同源比对信息显示，rstB基因为一糖基转移酶基因，参与细胞壁的合成。在研究rstB基因在烟草中的表达定位，验证其耐盐性基础上，我们利用它对苜蓿进行了耐盐性遗传改良。
基于对rstB基因进行真核生物偏爱性密码子改造和人工合成，并在大肠杆菌中验证mrstB基因表达蛋白效果的基础上，采用重组克隆的方法构建rstB-GFP和mrstB-GFP融合基因表达载体，农杆菌介导法获得转基因烟草再生苗。激光共聚焦显微镜观察发现，转融合基因烟草的根部有很强的绿色荧光，茎中导管、叶脉导管和气孔内壁有绿色荧光，并且，mrstB-GFP烟草相应部位荧光更强。提取根、茎、叶的可溶性蛋白进行Western检测显示，转融合基因烟草根中分别检测到rstB-GFP或mrstB-GFP融合蛋白，而叶片和茎检测不到。质壁分离试验显示，荧光区在细胞膜外侧，靠近细胞壁。免疫胶体金定位技术检测rstB-GFP融合蛋白结果显示，转融合基因烟草的细胞壁上特异性地结合大量的胶体金颗粒，表明rstB蛋白是分泌型蛋白，定位在细胞壁上，有在根部表达(或积累)的偏好性。
构建带有rstB和mrstB而无常规标记基因的表达载体，农杆菌介导法获得NaCl抗性的烟草再生苗。分子鉴定显示，直接用170mMNaCl为选择压筛选获得的再生苗PCR阳性率为80％以上；获得再生芽后，再用200mMNaCl筛选获得的再生苗PCR阳性率在60％以上。转mrstB基因烟草的再生苗在两种筛选条件下，PCR阳性率均较高。本实验说明，rstB和mrstB均可以提高植物的耐盐性，rstB基因改造有效，它们可以作为筛选标记基因。
酵母双杂交筛选与rstB蛋白互作的蛋白因子的试验结果显示，互作蛋白中有典型的细胞壁结构蛋白，有参与胞外基质和胞内信息转导、定位在细胞膜上的膜整合蛋白相似蛋白，有类似于细胞壁缔合蛋白激酶胞内结构域(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)的蛋白，有参与次级代谢调控的一些酶类，也有已经证明可以提高植物的耐盐性或是参与超敏反应的蛋白。可见，rstB蛋白的表达会与植物体内一系列蛋白发生作用，而这种互作应该与rstB基因提高植物的耐盐性相关。但是，rstB蛋白与植物内源蛋白互作是如何影响植物耐盐性的还有待深入研究。
农杆菌介导法成功获得了三个品种苜蓿的转基因再生苗。耐盐试验结果显示，转基因苜蓿叶片外植体可在含1.0％NaCl的培养基上形成愈伤，体细胞胚可以在含有0.3％NaCl的MS培养基上萌发；而野生型苜蓿在含0.5％NaCl培养基上愈伤形成就有受抑制表现，体细胞胚在含0.2％NaCl的MS培养基上就不能萌发。转基因苜蓿种子萌发率、根长都优于对照。模拟田间耐盐实验结果显示，转基因T1代烟草、苜蓿，在NaCl胁迫下较对照表现较快的生长速度，较高的生物量和较好的植株形态。转基因烟草可以在200mMNaCl胁迫下完成生活史，转基因苜蓿可以在50mMNaCl胁迫下完成生活史，在100mMNaCl胁迫下开花。盐胁迫两周后，原子吸收分析显示，在高浓度NaCl胁迫下，转基因苗的根和叶片积累较少的钠离子和较多的钙离子；转基因烟草和苜蓿在200mMNaCl胁迫下积累的脯氨酸含量较对照低，而可溶性糖含量较对照高。转基因苜蓿材料已申请进入安全性评价中间试验。
rstB基因;植物耐盐性;转基因再生苗;转基因烟草;转基因苜蓿;安全性评价
中国农业大学
博士
遗传学
王涛
2006
中文
S541;Q943
105
2007-07-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）