杜氏盐藻钙依赖蛋白激酶CDPK基因的克隆、表达载体的构建及对拟南芥的遗传转化
钙依赖蛋白激酶(CDPK)是植物和一些原生生物所特有的一类丝氨酸/苏氨酸型的蛋白激酶，参与环境胁迫信号的转导是CDPK的重要作用之一。在干旱、寒冷和低渗透等多种因子的作用下都引起CDPK基因的特异性表达和mRNA的特异积累。杜氏盐藻是一种真核单细胞绿藻，可以在0.1～5.5mol/L的NaCl溶液中生长，是研究藻类植物耐盐机制的较好模型。杜氏盐藻之所以能耐受盐胁迫与其细胞中CDPK基因的存在有关。为了从基因水平上研究其耐盐机制，本实验利用同源克隆的方法成功克隆到杜氏盐藻CDPK基因并将其转入模式植物拟南芥中，这将为下一步功能研究以及与耐盐相关的植物渗透胁迫诱导基因的克隆奠定了实验基础，同时也为培育高效耐盐植物以及缓解土壤盐渍化问题的解决奠定了基础。本实验研究的内容主要包括以下四个方面：
1.利用同源克隆的技术从杜氏盐藻中顺利克隆到一条636bp的DNA片段，测序分析发现其同拟南芥的CDPK基因有60.3﹪的同源性，然后以该片段为基础，利用RACE技术构建了全长序列。
2.植物表达载体pBI121-CDPK的构建与鉴定：利用DNA重组技术，将杜氏盐藻CDPK基因克隆至植物表达载体pBI121中，通过酶切、电泳鉴定CDPK基因已成功构建到植物表达载体pBI121中；然后将重组质粒pBI121-CDPK通过冻融法导入根癌农杆菌EHA105中，Kan平板筛选阳性克隆，有单菌落生长，证明重组质粒已转入根癌农杆菌EHA105中。
3.花序浸泡法转化拟南芥：生长于花盆中的拟南芥植株，其花序枝刚伸出时，摘除初生花序枝，当次生花序枝长到6～10cm时，用农杆菌菌液浸染30s～6min；约3周后收获种子，做Kan抗性筛选有90﹪的阳性苗。
4.对转基因植株进行分子生物学检测：PCR检测结果显示有3﹪的阳性苗，证明CDPK基因已转入拟南芥中。
藻类植物;杜氏盐藻;耐盐机制;同源克隆;钙依赖蛋白激酶;基因克隆;表达载体;转基因拟南芥
甘肃农业大学
硕士
草业科学
曹致中
2006
中文
S540.34
59
2007-05-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）