农杆菌介导的拟南芥液泡膜Na<'+>/H<'+>逆向转运蛋白基因（AtNHX1）转化烟草和马铃薯的研究
液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白可使Na+区隔化进液泡，从而对细胞质内Na+解毒和细胞渗透调节起作用，是盐生植物和耐盐甜土植物抵御盐胁迫所必需的。本研究利用拟南芥液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因——AtNHX1首先进行模式植物——烟草的遗传转化，以确定该蛋白的功能，然后进行目标作物——马铃薯的遗传转化，创造马铃薯耐盐种质资源，为耐盐品种的培育奠定基础。已取得的研究结果如下：1.烟草遗传转化体系的优化：(1)卡那霉素选择压的确定：CV87品种为转化受体材料时，叶片分化和茎段根再生时的卡那霉素浓度应为50mg/L。T12品种作为转化受体材料时，叶片分化时的卡那霉素筛选浓度应为100mg/L，根形成时的卡那霉素浓度为200mg/L；(2)头孢类抗生素对烟草叶片分化的影响及对根癌农杆菌的抑菌效果：不同浓度的6种头孢类抗生素(头孢曲松钠、头孢噻肟钠、头孢哌酮钠、头孢唑啉钠、头孢拉定和头孢他啶)对烟草叶片分化的影响不大，分化率均在85﹪以上；200mg/L头孢曲松钠和头孢噻肟钠就能对根癌农杆菌LBA4404起到较好的抑菌效果，并可使继代3次(60d)的烟草转化植株脱菌；(3)遗传转化条件的确定：叶片无需预培养、农杆菌OD600值0.3～0.5、侵染时间8～10min、共培养3d；
2.烟草转化植株的获得：(1)对经卡那霉素筛选生根的烟草进行特异引物的PCR扩增，获得了1617bp的特异性片段，表明AtNHX1基因已导入烟草基因组中；(2)转基因烟草植株的耐盐性表现：转基因植株耐盐性明显提高，表现在含1.0﹪NaCl的MS培养基上可正常生长，在含1.5﹪NaCl的MS培养基上可发出根系，未转基因植株则不能正常生长；
3.(1)马铃薯试管薯的诱导：液体培养法诱导效果最好，平均每株结薯3个。诱导方法为：将接于MS液体培养基+3﹪蔗糖上的试管苗茎段，在25±1℃、2500Lx连续光照下培养，25天后倒出培养基，加入MS液体培养基+8﹪蔗糖+5.00mg/L6-BA+0.15﹪活性碳，2500Lx连续光照下培养2天，再放入25±1℃黑暗下培养8周；(2)马铃薯转化外植体及培养基的确定：试管薯薄片是较茎段转化率明显高的外植体，适宜的分化培养基为MS+1.00mg/LIAA+0.20mg/LGA3+2.00mg/LZT+0.50mg/L6-BA；(3)马铃薯遗传转化体系的优化：1)卡那霉素选择压的确定：分化阶段和生根阶段的卡那霉素浓度均为50mg/L；2)遗传转化条件的确定：试管薯薄片无需预培养，农杆菌OD600值0.5，侵染时间8～10min，共培养2d；
4.马铃薯转化植株的获得：(1)对经卡那霉素筛选生根的马铃薯转基因植株进行特异引物的PCR扩增，获得了1617bp的特异性片段，表明AtNHX1基因已导入马铃薯基因组中；(2)转基因马铃薯植株的耐盐性表现：转基因马铃薯植株的耐盐性明显提高，表现在含0.6﹪浓度的NaClMS培养基上，转基因植株能正常生长，未转基因植株则生长受阻。
拟南芥液泡膜;烟草;马铃薯;遗传转化;根癌农杆菌;耐盐品种;转基因植株;逆向转运蛋白基因
甘肃农业大学
硕士
蔬菜学
张俊莲
2006
中文
S572.03;S532.03;Q943.2
53
2007-05-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）