水稻新型Na<'+>/H<'+>逆向转运蛋白基因（Osant1）的克隆、表达和遗传转化
在耕地面积有限的情况下，提高盐渍化土壤的作物产量潜力，对于促进我国农业的可持续发展具有重要意义。位于液泡膜上的Na+/H+逆向转运蛋白，具有将盐胁迫条件下植物吸收的过多Na+转运至植物液泡中的功能，在维持植物在高盐条件下原生质中的内稳态和抵御盐分危害中具有重要作用。本项研究在耐盐能力较强的水稻品种(TP309)中，克隆了1个与AtNHX1高度同源的新型水稻Na+/H+逆向转运蛋白基因(Osant1)，对于该新型基因的结构和编码蛋白特征、时空表达特性进行了较全面的研究。构建了Osant1和该基因启动子的植物双元表达载体，通过用上述表达载体遗传转化拟南芥，初步获得了Osant1和该基因启动子的转基因拟南芥植株，为通过转基因技术鉴定Osant1的抗盐能力和揭示该基因的精细表达特征鉴定了基础。
本项研究的主要结果如下：1、以拟南芥Na+/H+逆向转运蛋白基因AtNHX1为基础，在国际生物信息学网站NCBI进行BLAST分析，发现与AtNHX1高度同源的水稻可能Na+/H+逆向转运蛋白基因(GenBank登陆号：AK064004)。以盐胁迫水稻叶片总RNA为模板，依据AK064004的ORF设计正反引物，扩增出长度约为1.6Kb的cDNA片段。对该扩增产物与pUCm-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α后的阳性克隆测序结果表明，插入片段长度为1608bp。
2、用DNAStar软件将RT-PCR扩增产物序列与AtNHX1比对分析表明，该基因与AtNHX1高度同源(73.3﹪)，与AK064004的cDNA序列相同，命名为Osant1。Osant1全长2178bp，其中开放阅读框(ORF)为1608bp，5'与3'端的非编码区分别为179bp和391bp。在基因组水平上，Osant1含有14内含子，15个外显子。
3、用ExPasy蛋白分析软件对Osant1编码蛋白分析表明，Osant1含有535个氨基酸残基，分子量为59.1KD。Osant1含有液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白共有的保守序列(LFFIYLLPPI)。对Osant1与植物种属其他高度同源蛋白进行系统进化树分析发现，Osant1和拟南芥(AtNHX1)、玉米、小麦、大麦、马蔺、芦苇和偃麦草的Na+/H+逆向转运蛋白高度同源(79.9﹪～92.6﹪)。跨膜域分析发现，该蛋白含有Na+/H+逆向转运蛋白共有的12个跨膜域。表明Osant1是定位于液泡膜上的Na+/H+逆向转运蛋白。
4、在0、50mM、100mM和200mMNaCl溶液处理24h后，植株根、茎和叶中Osant1的表达特性研究表明，在对照植株(0mM)中，不同器官的Osant1表达水平均很低，随着盐分处理浓度的增加，根、茎和叶中的Osantl表达水平均呈不断增加趋势。表明Osant1的表达受盐分胁迫的诱导，且在一定盐分浓度范围内，随着盐分浓度的增大，Osantl被诱导表达的水平越高。不同器官相比，以茎中的表达水平较高，根系和叶片中表达水平均偏低且两者差异较小。
5、对200mMNaCl溶液处理植株0、6h、24h和48h后的Osantl表达水平分析表明，根、茎和叶中Osant1的表达水平大体表现为随着盐分处理时间的延长而不断增加。其中，在处理24h内，表现为随处理时间的延长，表达水平的增幅较大；以后至处理48h，随着处理时间进程各器官中Osant1表达水平的增幅较小。表明Osant1的表达在一定处理时间内具有时间调控效应。
6、采用常规分子克隆技术，构建了将Osant1编码阅读框(ORF)正确插入至表达载体pCAMBIA1305相应位点的植物双元表达载体pCAMBIA1305-Osant1。用该双元表达载体转化农杆菌LBA4404采用花序浸染法转化拟南芥。将收获的拟南芥种子消毒后，种植播于含有20mg/L潮霉素B的MS固体培养基上光照培养。筛选出具有选择抗性的遗传转化植株。
7、用水稻TP309DNA为模板，根据Osant15'侧翼启动子区序列设计正反向引物，扩增了Osant1的启动子(1385bp)。用启动子调控元件分析软件PLACE对该启动子分析发现，该启动子含有多个参与调控下游基因的调控元件，包括被RNA聚合酶识别、激活转录的CAAT框、水稻转录因子作用的GATA框、与GT1-1ike转录因子相互作用的GT-1盒、调控转录效率保守调控元件TATA盒，以及植物耐非生物胁迫相关基因启动子具有的CANNTG框。采用分子克隆技术，构建了将Osant1启动子正确插入至表达载体pCAMBIA1305相应位点的植物双元表达载体pCAMBIA1305-Osant1。用该双元表达载体转化农杆菌LBA4404获得的阳性克隆，转化拟南芥后获得了转基因植株。为下一步鉴定Osant1启动子的功能、以及采用启动子缺失分析技术鉴定调控该基因对盐胁迫响应的调控元件奠定了基础。
水稻;盐分胁迫;逆向转运蛋白基因;编码蛋白特征;基因表达;遗传转化
河北农业大学
硕士
作物栽培与耕作学
肖凯
2006
中文
Q943.2;S511
60
2007-05-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）