苏云金芽孢杆菌vip3A基因鉴定、克隆及杀虫活性分析
本研究系统地进行了vip3A基因的PCR-RFLP(多聚酶链反应-限制性片段长度多态性)鉴定，目前，国内外还未见正式报道。通过此方法对实验室保存的606株苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，简称Bt.)菌株的vip3A(营养期杀虫蛋白；VIP)基因型进行了鉴定；对BtAL和Bt41两Bt菌株所含的cry和vip3A基因型进行了鉴定；完成了菌株BtALvip3A因的克隆、表达及对甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、棉铃虫(Helicoverpaarmigera)、小菜蛾(Plutellaxylostella)和玉米螟(Ostriniafurnacalis)幼虫的生物活性测定；并克隆得到Bt41中vip3A的基因片段。
本研究建立了PCR-RFLP的方法，筛选vip3A基因。此方法根据五种vip3A基因的保守区设计一对通用引物，用来扩增vip3A基因的1,456bps的基因片段，此片段经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后，电泳检测酶切条带大小，根据电泳图谱，确定基因类型。通过此方法，从鉴定的606株Bt菌株中有382株得到vip3A基因扩增产物，约占总数的63﹪，说明vip3A基因的分布广泛。根据酶切电泳显示，共有三种RFLP图谱，315株含有与已知vip3Aa1相同的电泳图谱(860，260，190和160bps)，另外发现两种新的RFLP图谱与已知5种基因不同，其中52株(含菌株BtAL)的电泳图谱显示860，260，160，150bps条带；15株(含菌株Bt41)的电泳图谱显示1，100，190和160bps，均不同于其他已知vip3A的RFLP图谱。
对含有新vip3A基因的BtAL菌株质粒DNA进行cry和vip3A基因鉴定，发现其含有cry1Ab，cry1Ca，cry1Cb，cry1Fb，cry1Bd，cry1Ib，cry2Ab，cry9Eb和新型vip3A基因。以BtAL菌株质粒DNA为模板扩增得到2.37kbvip3A基因产物，插入到表达载体pET-21b上，得到重组质粒pBvip，完成克隆和测序，并将序列提交GenBank登记，Accessionnumber为DQ241674，Bacillusthuringiensis杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Vip3Aa19。序列分析表明Vip3Aa19蛋白由789个氨基酸组成，分子量为88.7kDa，该蛋白等电点为pH5.17，为弱酸性蛋白。与所有的Vip3类蛋白作了同源关系分析，此蛋白与已知Vip3Aa12具有最高为97.6﹪的序列同源性，存在19个氨基酸残基的不同。将含有pBvip质粒的大肠杆菌在0.7mmol/LIPTG，18℃，130r/min条件下，诱导表达18小时，提取表达产物，SDS-PAGE分析表明vip3Aa19基因在E.coli中表达蛋白为可溶的。生物活性测定表明表达产物对甜菜夜蛾幼虫具有显著的杀虫活性，LC50为1.43ng/mg饲料；对棉铃虫和小菜蛾幼虫也具有显著的杀虫活性，LC50分别为24.14ng/mg饲料和59.82μg/mL；但此蛋白对玉米螟活性不高，LC50大于100μg/mL，只具有一定的体重抑制作用。
对含有新vip3A基因的Bt41菌株质粒DNA进行cry和vip3A基因鉴定，发现菌株Bt41含有cry1Aa，cry1Cb，cry1Ie和一种新型vip3A基因。并从Bt41菌株中克隆得到了vip3A的基因片段1,456bps，测序结果显示其蛋白序列与已知Vip3Af1具有83﹪的序列同源性。在GenBank登记，Accessionnumber为DQ250256.
本研究发现了两种新的vip3A新基因，完成了vip3Aa19基因的克隆及活性测定，确定了对鳞翅目昆虫甜菜夜蛾的高毒力。由于甜菜夜蛾是一类危害极其严重、抗性上升较快的世界性害虫，而现有的Bt产品对该类害虫的田间防效较低，所以，此基因的发现对于甜菜夜蛾的防治具有重要意义。
苏云金芽孢杆菌;营养期杀虫蛋白;甜菜夜蛾;小菜蛾;vip3A基因
河北农业大学
硕士
微生物学
檀建新;宋福平
2006
中文
S763.42;Q78
76
2007-05-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）