黑曲霉A9葡萄糖氧化酶的提取纯化及其酶学性质研究
葡萄糖氧化酶在食品、医药及生物等领域有着广泛的应用。本论文建立了一套操作简单且易于工业化应用的黑曲霉A9葡萄糖氧化酶的提纯方案，并系统研究了其酶学性质。
本试验以实验室所保存的一株黑曲霉A9为发酵菌株，采用10L发酵罐生产葡萄糖氧化酶，发酵四天，得菌丝体，经过破壁，缓冲液提取，获得胞内葡萄糖氧化酶的粗酶液，然后经超滤浓缩、硫酸铵盐析、SephadexG-25脱盐、DEAE-纤维素离子交换层析及SephadexG-100凝胶层析进行分离纯化。试验结果表明，通过控制离子交换层析与分子筛层析这两步的具体操作条件，大部分杂蛋白被除去，所得酶蛋白经PAGE电泳鉴定为单一条带，达到电泳纯，测定该纯化酶的比活达349.84U/mg，比初始发酵液提高了15.83倍，酶蛋白得率达到23.75﹪。
在获得纯化葡萄糖氧化酶的基础上，对其酶学性质进行了系统研究。经SDS-PAGE测定，葡萄糖氧化酶的分子量为138,200Da，由两个相同的亚基组成，每个亚基的分子量约为70,210Da。硫酸-苯酚法测得其糖基化程度为2.67﹪。葡萄糖氧化酶底物专一性强，以葡萄糖为底物，采用双倒数作图法，测定其Km值为35.74mmol/L，Vmax值为35.71μmol/min。酶蛋白的最适pH为6.7，最适温度为30℃。该酶的pH稳定范围较宽，在pH4～8范围内较稳定，在pH5.0～5.5范围内保温2天，酶活基本不变，在pH6.0～8.0范围内保温也较稳定，酶活均保持在72﹪以上，pH4.0时酶活下降至60﹪左右。该酶在30～50℃范围内热稳定性良好，酶活基本不变，均保持在90﹪以上；60℃处理70分钟，还残存51﹪的活力，可见该酶可用于温度较高的反应，这对于工业化应用具有一定的价值，因为高温在一定程度上可减少杂菌污染，降低生产成本。金属离子对酶的催化反应有一定影响，Ag+、Hg2+、亚硫酸氢钠对酶蛋白有强烈的抑制作用，Cu2+、Fe2+则表现稍微的抑制作用，而Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+等具有不同程度的激活作用。
本论文对葡萄糖氧化酶的提取、纯化及酶学性质做了基础性研究，为进一步研究GOD的催化机理、分子克隆以及工业化应用提供了一定的理论指导。
黑曲霉;葡萄糖氧化酶;分离纯化;发酵菌株
河北农业大学
硕士
微生物学
贾英民
2006
中文
Q939.97
47
2007-05-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）