PCR技术检测肉及肉制品中金黄色葡萄球菌研究
金黄色葡萄球菌是引起细菌性食物中毒的重要病原菌之一，国内外由金黄色葡萄球菌引发的食物中毒屡屡发生。引起食物中毒的食品多为动物性食品、乳及乳制品等。目前，国内检测食品中金黄色葡萄球菌仍采用传统的方法，其操作繁琐，检测时间较长，通常需要3～5天才能完成，且灵敏度较低。本研究建立了一套快速检测肉及肉品中金黄色葡萄球菌的PCR方法，以缩短食品中金黄色葡萄球菌的检测时间，消除PCR反应抑制因子，提高检测方法的灵敏性。
本研究以金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)为靶基因，选择特异性引物，进行PCR扩增，检测肉及肉制品中的金黄色葡萄球菌。对PCR反应体系中镁离子浓度、模板量及退火温度和循环数进行优化，以确定适宜PCR反应体系和PCR扩增程序，其适宜反应体系为：5μL10×PCRbuffer，4μLdNTPs混合物，1μL20μmol/L正向引物，1μL20μmol/L反向引物，最适镁离子浓度为1.5mmol/L，0.25μL(5U/μL)Taq，水38.75μL，总反应体系50μL；其适宜PCR扩增程序为：PCR反应采用冷启动，94℃预变性4min，再按94℃1min-58℃0.5min-72℃1.5min进行35个循环，最后72℃延伸3.5min。PCR反应产物在2﹪的琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统观察结果。对PCR扩增产物进行了DNA测序，PCR扩增产物DNA序列与文献报道的靶基因序列的同源性达99.6﹪，从而证实PCR扩增产物确为目的扩增产物。本研究共检测了54株菌，以验证引物的特异性，结果表明：33株金黄色葡萄球菌中33株均为阳性结果；21株其它菌株均为阴性结果。因此该引物特异性强，可用于PCR检测金黄色葡萄球菌。
采用FTA滤膜制备模板进行PCR扩增，其方法的灵敏度为2cfu/20μL反应体系。
对FTA滤膜用于肉中金黄色葡萄球菌PCR直接检测(无需增菌)模板制备的具体方法进行了研究。结果表明：使用FTA滤膜制备模板时，FTA滤膜吸附样品，干燥后采用10﹪SDS煮沸该滤膜，可消除结合在FTA滤膜上的PCR抑制因子，采用该方法制备的模板可有效的扩增出目的基因。
采用FTA滤膜制备模板，利用PCR技术直接检测(无需增菌)人工污染的肉及肉制品中的金黄色葡萄球菌，以确定检出限。结果表明：猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉及熟肉制品匀浆液的检出限均为101cfu/g。可在6h内完成对肉中金黄色葡萄球菌的检测，比目前普遍采用的先增菌再进行PCR检测的方法缩短了12～24h。比较了PCR检测肉及肉制品中金黄色葡萄球菌的7种DNA模板制备方法，结果表明：FTA滤膜法可高效从样品中提取金黄色葡萄球菌DNA，可有效的消除PCR反应的抑制因子，灵敏度高、操作简便、耗时短，该方法明显优于其他方法。
实际检测了72份样品，同时与GB4789.10-94方法及两种快速检测致病性金黄色葡萄球菌的方法做了比较，结果表明：GB4789.10-94方法检出率为70.8﹪，检出时间为5d，PCR方法的检出率为73.6﹪，敏感性为100﹪，特异性为90.5﹪，符合率为97.2﹪，检出时间为6h，PetrfilmRSA方法的检出率为61.1﹪，敏感性为98﹪，特异性为100﹪，符合率为98.6﹪，检出时间为18h，Baird-ParkerR.P.F方法的检出率为69.4﹪，敏感性为86.3﹪，特异性为100﹪，符合率为90.3﹪，检出时间为18h。因此，FTA滤膜用于PCR检测肉中金黄色葡萄球菌检出率高，敏感性高，耗时短。
研制出了新的FTA滤膜缓冲液，其效果明显优于FTA专用缓冲液，成本降低93.3﹪，大大降低了检测成本。
使用FTA滤膜法制备模板DNA，可高效的提取样品中的DNA，有效的消除PCR反应抑制因子，操作简便，为PCR快速检测食品中的致病菌构建了一个技术平台。
肉制品检测;金黄色葡萄球菌;食物中毒;PCR反应抑制因子
河北农业大学
硕士
微生物学
张伟
2006
中文
TS207.4;TS251.7
63
2007-05-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）