常见细菌性食物中毒快速检测试剂盒研制
细菌性食物中毒严重危害人类健康，预防和控制细菌性食物中毒的重要措施之一是快速、准确的检测致病菌。传统的检测以细菌培养、形态学、生理生化等方法为基础；操作程序复杂、耗时长。研究快速检测势在必行。
本实验首先通过免疫家兔分别制备了沙门氏菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌O157、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌的五种抗血清，除副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌抗血清外，其他三种抗血清基本涵盖了该菌绝大多数的致病血清型。将制备的抗血清采用(NH4)2SO4沉淀和SPA层析柱结合的方法进行纯化，结果显示(NH4)2SO4沉淀和SPA层析柱结合纯化的抗体，纯度和活性均可满足标记胶体金的需要。
采用柠檬酸三钠还原HAuCl4制备了三种不同粒径的胶体金，根据颜色、波长扫描曲线、扫描电镜结果，选择15nm胶体金颗粒标记抗体。通过试验胶体金标记抗体的最低稳定蛋白量为18mg/L，最适pH为pH8.2；根据最低稳定蛋白量和最适pH标记抗体制得免疫胶体金，低温超速离心纯化，通过免疫渗滤装置检测五种免疫胶体金，具有活性。将胶体金垫、层析膜、样品垫、吸水垫组装制成免疫层析条。胶体金垫是将浓度为5OD值(520m)的免疫胶体金均匀涂布在聚酯膜上，冷冻干燥后制得。
通过比较选用Millipore公司的HF13504作为层析用膜，质控线采用二抗(羊抗兔)浓度为0.25mg/mL，检测线为纯化的多克隆抗体浓度均为0.2mg/mL；样品垫、吸水垫均采用吸水性好的材料。五种层析条分别检测阳性菌株阳性率均为100﹪，检测阴性菌株除大肠杆菌O157检测条有非特异性反应外，其它层析条均无非特异性反应；五种层析条灵敏性有差异，但基本可达到10﹪fu/mL～107cfu/mL；检测时间短，层析条可在5min左右显示清晰的条带；稳定性良好，封闭在有干燥剂的塑料袋中可常温保存4个月。
单纯的层析条检测灵敏度较低。因此，采用实验室自制的纳米免疫磁颗粒，对1mL的样品浓集，然后采用60℃加热30min将菌体与磁颗粒分离，再用层析条检测。随后将层析条与免疫磁颗粒结合组装成“细菌性食物中毒快速检测试剂盒”。初步应用检测牛肉中的大肠杆菌O157，大肠杆菌O157检测条呈阳性，其它层析条均为阴性，灵敏度比单纯应用层析条检测可提高达1个数量级。
总之，本课题制备了检测沙门氏菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌O157、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌的五种免疫胶体金层析条，并辅以免疫磁颗粒组装成“常见细菌性食物中毒快速检测试剂盒”。首次将纳米磁颗粒与胶体金免疫层析条检测相结合，证明该结合具有可行性，并且是一种灵敏度高、特异性强、快速、稳定的检测方法。为制备检测更多种细菌的食物中毒快速检测试剂盒奠定了基础。
食物中毒;细菌性食物;快速检测;免疫层析
河北农业大学
硕士
微生物学
张伟;李君文
2006
中文
Q93-338;R155.31;TS207.4
67
2007-05-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）