苹果组培苗RT-PCR体系建立及外源CpTI基因在mRNA水平表达的研究
以转CpTI基因苹果(MalusdomesticaBorkh)组培苗(包括红富士、乔纳金、王林和皇家嘎拉等60个株系)为试材，对苹果组培苗中的外源CpTI基因进行了反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测技术研究。采用的技术流程为：通过提取苹果组培苗中总RNA获得CpTI的RNA，反转录合成cDNA，经PCR扩增获得CpTI的特征片段。本研究对RNA提取方法进行了研究，比较了目前常用的几种提取植物组织中总RNA的方法，建立了RT-PCR检测技术体系。主要研究结果如下：
1.酚类化合物、多糖、蛋白质和次级代谢产物是影响从苹果组织中提取总RNA的几个主要干扰因素。试验比较和改进了RNAplant试剂盒法、CTAB-异硫氰酸胍法、改良CTAB法、尿素法和热硼酸法等五种常用的植物组织总RNA提取方法。通过对RNA的质量、提取效率、提取时间以及试剂费用等多方面进行比较，提出改良CTAB法为从苹果组培苗中提取总RNA的最佳方法。该方法的提取缓冲液包括2﹪CTAB，2.0mol/LNaCl，100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，20mmol/LEDTA(pH8.0)，2﹪β-巯基乙醇(使用前加入)。该方法有效地去除了酚类化合物、多糖、蛋白质等污染，在3小时之内可得到高纯度、完整的、适宜进行RT-PCR操作的RNA模板，从而保证了检测的成功。
2.利用DNaseI去除RNA中的DNA后，采用M-MLV反转录酶，建立了适合苹果组培苗的反转录体系，合成的cDNA片段在100～1500bp之间，可满足对cDNA分析的要求。
3.依据CpTI基因序列设计合成特异引物，采用RT-PCR的方法扩增出了309bp的PCR产物，与预期目的片段长度一致。
4.适合苹果组培苗RT-PCR分析体系为：在反转录体系中，引物使用浓度为0.8μmol/L，RNA模板的用量为1.0μg；PCR选用25μL体系，引物浓度为0.6μmol/L，Mg2+浓度为1.6mmol/L，dNTPs浓度为300μmol/L，Taq酶用量为1.5U；PCR扩增程序为：94℃，2mins；94℃，50s，55℃，50s，72℃，100s；30循环；72℃，10mins；4℃保温。
5.对外源CpTI在60个株系苹果组培苗中的表达进行RT-PCR检测，结果如下：54和60号2个株系没有得到目的片段，42～50、52、55～59等15个株系得到的目的片段亮度暗，其余43个株系得到的目的片段明亮。
转基因苹果;苹果组培苗;外源CpTI基因
河北农业大学
硕士
果树学
杜国强
2006
中文
S661.1;Q943.2
47
2007-05-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）