鲢（Hypophthalmichthys molitrix）IL-10基因的克隆及原核表达
本研究采用RACE(rapidamplificationofcDNAends)-PCR方法首次扩增出鲢IL-10的cDNA，其全长为1248bp，包含5’非编码区156bp，3’非编码区552bp，开放阅读框540bp。鲢IL-10的开放阅读框编码179个氨基酸，其中包含构成两对二硫键的四个保守半胱氨酸。以15种动物及病毒的IL-10氨基酸序列构建系统发育树，并进行了相应的探讨。RT(reversetranscriptase)-PCR结果显示鲢IL-10mRNA主要在脾脏、鳃、头肾和肌肉中表达。
根据鲢IL-10的cDNA序列设计含有酶切位点的表达引物，将扩增的鲢IL-10完整开放阅读框和原核表达载体pET-32a-c(+)双酶切之后，连接、构建重组表达质粒，经测序无误后，将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中，用IPTG诱导表达。经SDS-PAGE电泳后显示重组融合蛋白在分子量约39kD左右处有明显表达条带，与预期分子量大小一致，且主要以不可溶的包涵体形式存在。变性条件下利用His·Bind树脂成功纯化融合蛋白，将其免疫日本大耳兔，获得兔多克隆抗鲢IL-10抗体，Westernblot检测到兔多克隆抗鲢IL-10抗体可有效地与重组蛋白结合。这为进一步研究IL-10的功能奠定了基础。
鲢;基因克隆;组织表达;表达质粒重组;原核表达
湖南农业大学
硕士
水产养殖
肖调义;聂品
2006
中文
S965.113;Q786
51
2007-05-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）