鼻咽癌TGFβ1/Smads信号通路功能及其基因治疗的初步研究
鼻咽癌是中国大陆东南沿海一带发生率较高的恶性肿瘤。TGFβ1/Smads信号通路与鼻咽癌发生发展的关系至今国内外都没有研究报道。本研究以鼻咽癌CNE2细胞为研究对象，从检测TGFβ1/Smads信号通路在鼻咽癌中的功能入手，研究它与鼻咽癌发生发展的关系。首先对TGFβ1/Smads信号通路的关键基因Smad4进行突变分析，证实了该基因编码序列没有发生突变，表明鼻咽癌是一种非Smad4突变的肿瘤。通过MTT实验发现，鼻咽癌细胞对TGFβ1的反应不敏感。进一步检测了TGFβ1/Smads信号通路受体蛋白和几个关键信号分子基因的表达情况以及pSmad2和Smad7蛋白的转位情况，发现pSmad2和Smad7蛋白在TGFβ1的刺激下，能正常的发生核转位，初步表明这个信号通路是完整的。但参与正调控的关键分子Smad2、Smad3和Smad4基因表达明显上调，而负调控作用的Smad7的表达与正常鼻咽组织和正常细胞相比，都没有差异，暗示正调控信号通路在肿瘤细胞中是增强的。
为了研究鼻咽癌细胞中正调控信号增强的机制，构建了含有U6启动子和针对Smad4基因的小分子RNA质粒表达载体，采用RNAi技术降低Smad4基因表达后，发现VEGF和MMP9基因的表达均上调，说明Smad4基因过表达能够抑制VEGF和MMP9基因的表达，起到抑制肿瘤恶性进展的作用，进一步确定了Smad4基因作为肿瘤抑癌基因的功能。
为了进一步确定Smad信号通路的增强机制，以及是否是依赖于Smad4信号，还是不依赖于Smad4信号，采用化学合成的方法合成了Smad3siRNA，降低Smad3基因表达后，发现MMP9基因的表达上调，而VEGF基因的表达出现下调，表明Smad3信号能够抑制MMP9基因的表达，而上调VEGF基因的表达。结合Smad4基因的研究，发现Smad3与Smad4都参与了细胞的EMT(epithelialmesenchymaltransition，EMT)进程；Smad3与Smad4基因的表达降低都不能恢复细胞对TGFβ1的敏感性；Smad3与Smad4都参与了抑制MMP9基因表达的调控，而Smad3通过一种不依赖于Smad4的途径促进VEGF基因的表达，VEGF基因在肿瘤细胞中的高表达，正是加速肿瘤恶性进展的原因。
为了将来更好的开展基因治疗，构建了表达抗菌肽CecropinAD(Cad)基因的真核表达质粒，将它转染到CNE2细胞中，发现Cad基因表达后，能明显抑制细胞的增殖；DNAladder实验、形态学观察以及流式细胞实验都证实基因表达后能够诱导鼻咽癌细胞凋亡，而对正常细胞几乎没有影响，预示它的临床应用前景，这也是首次发现Cad基因在肿瘤细胞内表达诱导细胞凋亡的现象，为今后开展基因治疗提供了一个有价值的候选基因。
总之，通过本论文的研究，初步证实了在低分化的鼻咽癌CNE2细胞系中，Smads信号通路正调控信号增强的原因，即信号通路的增强能够加速肿瘤细胞的EMT进程，同时Smad3能以不赖于Smad4的信号途径促进VEGF基因的表达，从而加速鼻咽癌的侵袭和转移。Cad基因在CNE2细胞内表达能够抑制细胞生长，诱导细胞凋亡，可以作为今后开展基因治疗的重要候选基因。
鼻咽癌;Smads信号通路;RNAi;CecropinAD;基因治疗
中山大学
博士
遗传学
徐培林
2006
中文
R739.6
138
2007-07-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）