斜带石斑鱼神经肽Y基因的克隆、原核表达与功能研究
神经肽Y(neuropeptideY，NPY)是一个由36个氨基酸组成的活性多肽，广泛分布在脊椎动物的中枢及外周神经系统中。鱼类的NPY具有参与摄食活动的调节、调控垂体激素的释放等多方面的生理功能。本研究采用RACE-PCR方法，对斜带石斑鱼NPY全长cDNA进行克隆和序列分析，应用RT-PCR结合Southernblot分析，对NPY在斜带石斑鱼2龄成鱼组织以及胚胎和仔鱼各阶段的mRNA表达进行半定量分析；建立NPY原核表达系统，表达和纯化了斜带石斑鱼pTRX-NPY融合蛋白；以斜带石斑鱼重组NPY为抗原，制备特异性的NPY抗血清，研究NPY在斜带石斑鱼脑组织和垂体中的分布情况；并采用离体孵育实验，研究了斜带石斑鱼重组NPY的生物活性和生理作用，主要研究结果如下：
1.本研究克隆的斜带石斑鱼NPYcDNA全长688bp，其中5'端非编码区长63bp，开放阅读框长300bp，3'端非编码区长325bp。采用DNAstar推导出的斜带石斑鱼NPY前体由99个氨基酸组成，从起始氨基酸(M)到第28位氨基酸(G)为28个氨基酸的信号肽部分，后接着是由36个氨基酸组成的NPY成熟肽，在蛋白水解加工位点Gly-Lys-Arg后的32个氨基酸组成NPY的羧基末端旁侧肽段。
对斜带石斑鱼与其它脊椎动物NPY前体氨基酸序列的同源性比较和进化树分析结果显示，斜带石斑鱼NPY前体与近源鱼种有较高的同源性。
2.在2龄雌性斜带石斑鱼神经组织和外周组织中，广泛地存在着NPYmRNA的表达。在嗅球、端脑、下丘脑、中脑-丘脑、延脑、小脑、脊髓等神经组织和垂体中都能检测到NPYmRNA的表达，其中下丘脑NPYmRNA的相对表达量最高。在斜带石斑鱼其它10个外周组织中检测到了NPYmRNA的表达，Southernblot分析结果显示，在视网膜、胃、性腺、胸腺、心脏、肝脏、皮肤和前肠等组织中出现了杂交信号，在鳃丝和血液中有较弱的杂交信号，未出现杂交信号的是脾脏、肾脏、头肾、红肌、白肌、中肠、后肠、脂肪等8个组织。本研究首次报道了在鱼类成体的垂体和其它非神经组织中有NPYmRNA的表达。
斜带石斑鱼NPYmRNA的这种组织表达模式提示，鱼类NPY的生理功能不仅可以通过神经内分泌系统发挥其中枢调节作用，还可能以自分泌或旁分泌的作用方式参与对鱼类外周组织功能的调节。
3.在未受精卵至胚胎发育桑椹胚期未能检测出NPYmRNA的表达，在高囊胚期至胚体形成期胚胎中检测到的NPYmRNA处于较低的表达水平，从晶体形成期胚胎至仔鱼出膜NPYmRNA的表达水平逐渐升高；从仔鱼出膜后第1天直到第52天的稚鱼中NPYmRNA的表达都处于较高水平，其中在第24天至第36天NPYmRNA水平升高至出膜后第1天的两倍。
结果提示，NPY可能参与鱼类胚胎发育晚期和幼体发育过程的调节。
4.选用以大肠杆菌TRX为融合伴侣的原核表达系统，构建了融合表达载体pTRX-NPY。低温和低IPTG(28℃，0.2mMIPTG)诱导4小时，pTRX-NPY融合蛋白表达量占总细菌表达量的54％，可溶性为87％。经Ni2+金属鳌合层析柱和SephadexG-25纯化和脱盐处理后的pTRX-NPY融合蛋白的纯度达97％。Westernblot结果证实，所表达的pTRX-NPY融合蛋白为斜带石斑鱼重组NPY。
结果表明，构建的pTRX-NPY表达载体在大肠杆菌中获得了较高的可溶性表达。
5.以纯化后的斜带石斑鱼重组NPY为抗原，免疫新西兰雄兔，获得了较高效价的斜带石斑鱼NPY兔抗血清。ELISA、Westernblot和免疫组织化学抗原吸收实验结果表明，斜带石斑鱼NPY多克隆抗体具有较高的特异性。
6.应用本研究制备的斜带石斑鱼NPY多克隆抗体对2龄雌性斜带石斑鱼部分脑组织和垂体进行了免疫组织化学实验。在斜带石斑鱼的端脑、中脑顶盖和下丘脑等组织中存在着丰富的NPY免疫阳性细胞和神经纤维，在斜带石斑鱼的小脑未观察到NPY免疫阳性反应细胞和纤维。在斜带石斑鱼的垂体中观察到神经垂体(NH)有丰富的NPY阳性纤维分布，在前、中和后腺垂体中均能检测到高密度的NPY免疫阳性细胞的存在。
结果提示，NPY在调节斜带石斑鱼的垂体功能活动中，可能存在着自分泌或旁分泌的作用模式。
7.采用离体静态孵育方法和半定量RT-PCR技术，检测了斜带石斑鱼重组NPY对斜带石斑鱼垂体碎片促甲状腺激素β亚基(TSHβ)mRNA表达的影响。结果显示，10-6MTRX蛋白不影响离体孵育的斜带石斑鱼垂体TSHβmRNA的表达，10-7M和10-6M斜带石斑鱼重组NPY能明显降低离体垂体TSHβmRNA的表达，10-9M猪NPY标准品能显著降低离体垂体TSHβmRNA的表达。
实验结果表明，NPY能在垂体水平影响斜带石斑鱼TSHβmRNA的转录，同时提示本研究融合表达的斜带石斑鱼重组NPY具有与哺乳动物NPY相似的生物学活性，可用于进一步的鱼类NPY功能研究。
8.观察了斜带石斑鱼重组NPY对离体孵育垂体碎片的生长激素(GH)mRNA和生长激素Ⅰ型受体(GHR-Ⅰ)mRNA表达的影响。结果显示，TRX蛋白对斜带石斑鱼的垂体GHmRNA和GHR-ⅠmRNA表达水平没有影响；斜带石斑鱼重组NPY和猪NPY标准品对离体垂体的GHmRNA转录水平没有明显的作用；猪NPY标准品能明显促进离体垂体GHR-ⅠmRNA的表达，斜带石斑鱼重组NPY能以剂量依存关系方式升高离体垂体GHR-ⅠmRNA的表达水平。
斜带石斑鱼重组NPY不影响垂体GHmRNA表达水平，这表明NPY对斜带石斑鱼GH分泌的调节不在转录水平上，可能具有转录后调控的机制。NPY明显促进离体斜带石斑鱼垂体GHR-ⅠmRNA的表达，提示NPY可能参与斜带石斑鱼垂体GHR-Ⅰ基因的表达调控。
斜带石斑鱼;神经肽Y;cDNA克隆;mRNA表达;融合表达;原核表达;离体孵育
中山大学
博士
海洋生物学
林浩然;李文笙
2006
中文
S965.334
168
2007-07-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）