单宁酸与胰蛋白酶和牛血清白蛋白相互作用的研究
第一章:简要概述了单宁的研究现状及发展趋势、单宁与蛋白作用的研究进展及单宁与蛋白作用的理论,提出了本文立题的意义及研究内容。第二章:采用荧光光谱法研究了TA与Trypsin的相互作用。探索了TA与Trypsin作用的基本条件。发现TA与Trypsin作用的过程中存在快反应和慢反应两个过程。针对两个反应过程,用滴定和作用24小时两种方式研究了不同pH值二者的相互作用。在各pH值TA对Trypsin的荧光均具有较强的猝灭作用,且都引起Trypsin最大发射峰的峰位发生红移;TA对Trypsin的猝灭为静态猝灭过程;通过计算求得了不同pH值的表观结合常数KA及结合位点数n;并得出不同pH时TA与Trypsin作用力类型不同。
第三章:应用紫外分光光度法研究了TA对Trypsin酶活力的影响。结果表明TA能迅速抑制Trypsin的酶活力。通过双倒数作图法,求得Trypsin的米氏常数Km值为1.7×10-5mol·L-1;TA对Trypsin酶活性抑制类型为竞争性和非竞争性的混合型抑制;抑制常数Ki、Ki'分别为4.55×10-6mol·L-1,6.50×10-5mol·L-1;并求得了不同TA浓度时的VmappKmapp。表明TA不仅能与Trypsin结合猝灭其荧光,且对其酶活性有较强的抑制作用。由紫外可见光谱法计算所得TA与Trypsin作用的亲和常数(l/Ki)与荧光光谱法所得TA与Trypsin作用的KA结果较一致。
第四章:应用荧光光谱法在25℃,pH7.4时研究了TA与模型蛋白BSA的相互作用。结果表明TA与BSA作用也可以分为两个过程。而且TA对BSA具有较强的荧光猝灭作用,能使得蛋白的最大发射峰发生红移,说明能够通过改变蛋白质的构象进而改变色氨酸的疏水环境。且经研究证实TA对BSA的荧光猝灭属静态猝灭过程。25℃时二者在快反应和慢反应过程中作用的结合常数KA分别为3.16×105L·mol-1和3.55×108L·mol-1且结合位点数n分别为0.86和1.42。热力学参数△H>0,△S>0,判断作用力类型主要为疏水作用。此外,按照非辐射能量转移理论,计算了TA与BSA中212位色氨酸残基间的距离,分别为2.21nm(RRS)和1.97nm(SRS),结合部位为BSA的SiteⅡ的SubdomainA的疏水腔中,慢反应过程后较快反应过程更加接近色氨酸残基。说明慢反应过程较快反应过程TA与BSA结合更加稳定。
第五章:在25℃,pH7.4时,利用疏水荧光探针TNS研究了TA与BSA的相互作用。分别在295nm和322nm激发下,研究了TNS与BSA-TA复合物的作用及TA对BSA-TNS复合物的影响。结果表明TNS的加入使得BSA-TA复合物在345nm处的荧光强度下降,而在440nm处出现新的荧光峰。TA对BSA-TNS复合物的荧光猝灭为静态猝灭过程。通过将295nm激发用345nm处荧光强度求得的KA与322激发用440nm处的荧光求得的KA比较,得出了一致的结果,并推测295激发时用440nm处荧光强度求得的KA较322nm激发用440nm处荧光强度求得的KA大,可能是由于TNS阻止了TA与BSA的结合或者TNS将TA从BSA中挤下来或者是由于TA结合后使BSA的疏水环境改变,有待进一步深入研究。
第六章:通过研究离心前后TA与Trypsin及BSA两种蛋白作用的共振光散射光谱。TA与Trypsin作用形成聚集物,而TA与BSA作用未形成聚集物,说明TA与不同的蛋白作用发生聚集的程度不同。
单宁酸;胰蛋白酶;牛血清白蛋白;酶活力;荧光光谱法
山西大学
硕士
运动人体科学/生物化学与分子生物学
赵春贵
2006
中文
Q556.9;Q503
66
2007-07-02(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)