长筒石蒜花瓣cDNA文库构建与表达序列标签（ESTs）分析
我国石蒜属植物不仅种类繁多，而且具有丰富的花色、花型变异。其中长筒石蒜种内变异最为丰富。
以cDNA文库为基础的ESTs(ExpressedSequenceTags，表达序列标签)技术是一种快速地进行基因功能分析及发现新基因的有效方法。为了开展识别和分离花色、花型相关基因研究，本文构建了长筒石蒜的花瓣cDNA文库，并以该文库为材料进行大规模的5’端EST测序和生物信息学分析。本研究获得的主要结果如下：
1.以采用改良的异硫氰酸胍法从长筒石蒜花瓣中提取总RNA法，分离纯化富含PolyA的mRNA，经反转录酶反转录合成双链cDNA，通过胶纯化回收法筛选出其中大于500bp的片段与载体pBluescript连接，最后用电转化法转化宿主菌ElectroMAXDH10B，构建了长筒石蒜花瓣初级cDNA文库。经质量检测，初级文库的库容为1.12×106个/mL，符合高质量文库的要求。文库的重组率为96.8％，且插入片段的长度在0.8～3.0kb之间，说明文库是完整、有效的，可以用于大规模EST序列测定及数据分析。
2.从长筒石蒜花瓣初级cDNA质粒文库中随机选取3676个克隆进行测序，经Phred软件进行编辑后，获得长度大于100bp的有效序列为3584条，其序列的平均长度为449bp，序列平均质量数为37.06；另外通过GC含量分析获得长筒石蒜花瓣EST的GC含量为45.28％
3.利用Phrap软件对长筒石蒜花瓣3584条有效EST序列进行片段重叠群分析和拼接后共获得2764个独立基因(Unigene)，其中包括431个片段重叠群(Contig)和2333个独立的ESTs(Singlet)。
4.随机测序所获得的同一基因的EST的数目可以在一定程度上代表该基因在该组织中的表达丰度。有效序列BIastX分析表明，丰度较高的基因(表达频率≥5)有42个，约占总数的9.039％；中等丰度基因(表达频率在2～5之间)113个，约占总数的25.871％；其余低丰度的基因约占65.09％。这说明在长筒石蒜花瓣基因中，高丰度表达基因比较少，大多数呈中低丰度表达。
5.所有有效序列与NCBI的核酸数据库进行BLAST比对，有28.99％(1039/3584)的序列显示了与已知序列高度的同源性；而与蛋白质数据库进行比对时有62.27％(2232/3584)的序列显示了与己知序列的同源性。
6.根据SWISSPORT数据库注释的ACCESSION，将独立基因(Unigene)以GeneOntology进行功能分类。1917个具有同源性匹配的序列(被注释)的基因中，按照GO的分子功能、生物过程和细胞组分分三个不同分类角度分类，被赋予功能的基因累计达到2256个(包括一因多效)。把通过BlastX比对获得长筒石蒜花瓣有功能描述基因(包括功能确定的及推测功能的)分为11类，即代谢相关基因(Metabolism)的EST数量占有功能描述基因的26.42％、蛋白质合成相关基因(Proteinsynthesis)的EST占功能描述基因的21.28％、能量代谢相关基因(Energy)占17.24％、细胞内运输相关基因(Transporters)占10.02％、转录相关基因(Transcription)占6.17％、信号转导相关基因(Cellularsignaltransduction)占5.31％、细胞生长发育相关基因(Cellgrowthanddivision)占4.34％、细胞抗性及防御相关基因(Diseaseanddefence)占3.37％、细胞结构相关基因(CellstructureandCellcycle)占2.48％、次生代谢相关基因(Secondarymetabolism)占2.13％、蛋白质降解相关基因(Proteindestinationandstorage)占1.24％。
长筒石蒜;花瓣;cDNA文库;表达序列标签;功能基因;生物信息学
南京林业大学
硕士
林木遗传育种
潘惠新
2006
中文
S682.29;S603.6
72
2007-06-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）