CoCl<,2>对神经型一氧化氮合酶表达的作用及其调控机制研究
目的:缺血性脑损伤是一种严重威胁人类健康的疾病，其发病率，致残率和复发率极高。对其深入研究具有重要的理论和临床应用价值。神经细胞对缺血十分敏感，神经系统很多的疾病的发生，发展和缺血过程相关。在神经外科疾病的治疗中缺血和低氧也是影响病人预后的重要因素之一。神经型一氧化氮合酶(neuronalnitricoxidesynthase，nNOS)最早发现于大鼠的小脑组织，现已被证明广泛的存在于神经系统中，在维持神经元的功能如神经递质的传递，神经元发育，突触塑形，调节基因表达等方面发挥重要的作用，同时参与许多神经系统疾病的病理过程。除了神经系统外，还在其他很多组织如骨骼肌，肺，肾脏中发现了nNOS的表达。nNOS在体内具有多样而复杂的功能，它的基因结构和表达调节也十分复杂。一氧化氮合酶尤其是神经型一氧化氮合酶在神经系统缺血过程中起到重要作用。但是现在对它在神经系统缺血中的作用和调控的研究存在较大的分歧。我们的研究拟通过低氧化学模拟物CoCl2刺激神经母细胞瘤SK-N-SH，进而探讨nNOS在模拟低氧条件下的表达情况和调控机制。预适应是机体抗缺氧或缺血的一种内源性保护现象，在多种动物的心脏，肝、肾和脑等多种组织、器官和细胞中都发现了这种机制的存在，其中在心脏和脑中这种现象受到特别的关注。有研究认为nNOS在低氧预适应中起到重要作用，我们拟通过低氧的化学模拟物CoCl2刺激神经母细胞瘤SK-N-SH建立预适应模型，进而研究nNOS在低氧预适应中的作用，并对其预适应的机制进行初步研究。
材料与方法:1.实验材料：RNA提取试剂TRIzolReagent购自GIBCOBRL，逆转录试剂盒购自Promega，Real-timePCR试剂盒购自Takara，一氧化氮荧光染料DAF-Ⅱa购自Anxora，Real-timePCR相关引物和探针购自上海博亚生物技术有限公司，人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH购自中国科学院上海细胞生物研究所，PCR产物纯化试剂盒及柱离心胶回收纯化试剂盒均购自上海华舜生物工程有限公司丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺购自MERCK公司产品，琼脂糖购自Promega公司，载体连接系统pMD18-TVector购自Takara公司，PGL3-basic报告基因载体购自Promega公司，γ-32pATP购自北京福瑞德公司，双重荧光素酶报告基因检测试剂盒购自promega公司，抗体购自Santacruz公司。
2.实验方法：以CoCl2为低氧的模拟刺激刺激人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH，提取RNA，进行Real-timePCR定量分析nNOSmRNA的表达情况。以荧光染料DAF-ⅡA检测在刺激后NO产生情况；Western-blot方法分析在刺激后nNOS蛋白的表达情况。设计探针，以同位素标记，以EMSA的方法检测nNOSExon1f启动子区域的低氧反应元件(HRE)和C/EBPα反应元件的活性，并以ChIP的方法验证。构建PGL3-basic荧光素酶报告基因表达载体，在CoCl2的刺激下检测其报告基因的表达，鉴定反应元件的活性。以CoCl2为低氧的模拟刺激对人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH进行预适应刺激，以无血清模拟低氧刺激，MTT法检测细胞增殖，流式细胞方法检测细胞凋亡。提取RNA，进行RT-PCR分析nNOSmRNA和BCL-2，Apaf-1的表达情况。
结果:1.CoCl2刺激对SK-N-SH细胞nNOS基因表达的影响：Real-timePCR检测结果表明在CoCl2刺激下SK-N-SH细胞中nNOS的表达升高，并且呈时间和剂量依赖性。DAF-ⅡA荧光染料分析表明在CoCl2刺激下SK-N-SH细胞中NO的含量升高，在应用了nNOS特异性拮抗剂7-NI后可以使NO的含量下降，表明了在CoCl2刺激下SK-N-SH细胞中NO的含量升高至少有一部分来源于nNOS.Western-blot结果表明在CoCl2刺激下SK-N-SH细胞中nNOS的蛋白表达增高，而7-NI可以拮抗这种作用。
2.nNOSExon1f启动子区域低氧反应元件HRE的鉴定：EMSA的结果显示nNOSExon1f启动子区域的HRE可以和转录因子HIF-1α结合。ChIP结果表明在CoCl2的刺激下HIF-1α和该HRE的结合增强。pGL3荧光素酶报告基因的检测结果表明在CoCl2的刺激下含HRE的启动子活性增加60％。
3.nNOSExon1f启动子区域C/EBPα反应元件的鉴定：EMSA的结果显示nNOSExon1f启动子区域的C/EBPα结合位点可以和转录因子C/EBPα结合。ChIP结果表明在CoCl2的刺激下HIF-1和该C/EBPα反应元件的结合增强。pGL3荧光素酶报告基因的检测结果表明在CoCl2的刺激下含有C/EBP反应元件的启动子活性增加30％。
4.CoCl2对细胞血清剥夺的保护作用：CoCl2可以产生保护作用抵抗无血清的刺激，nNOS在这个预适应发挥重要作用，可以调节BCL-2，Apaf-1基因的表达。
结论证实了在CoCl2刺激下SK-N-SH细胞中nNOS表达在mRNA，蛋白和产物水平都升高。表明在神经细胞的低氧反应中nNOS起到重要的作用。本研究首次鉴定了nNOSExon1f启动子区域的低氧反应元件HRE和C/EBP反应元件。建立了一种预适应的细胞模型，证明nNOS在预适应中的重要作用。
神经型一氧化氮合酶;低氧诱导因子;CCAAT增强子结合蛋白;低氧预适应
中国医科大学
博士
遗传学
赵彦艳
2006
中文
Q421
102
2007-06-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）