小鼠胚胎干细胞的体外培养及向成骨细胞的转化
目的：系统的研究小鼠胚胎干细胞的提取、体外培养扩增和向成骨细胞定向诱导分化。方法：用13.5d左右的昆明小鼠胚胎，采用常温消化法制备小鼠胚胎原代成纤维细胞(PMEF)，加入专用的DMEM培养液，经丝裂霉素C处理后成为饲养层。在昆明小鼠受精后第4天，从子宫中取囊胚进行体外培养，4～5天后，获得大的巢式生长集落，使用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA，采用两步离散法，对内细胞团集落进行离散，接种在新鲜制备的饲养层体系中，加入适宜的含有白血病抑制因子(L1F)的培养基进行分化抑制培养，并进行传代和体外扩增。采用碱性磷酸酶染色、核型分析、类胚体实验对扩增细胞进行ESC鉴定。将小鼠5d龄ES-D3细胞源的类胚体(EBs)单细胞，按5×104/mL接种12孔细胞培养板，在DMEM基础培养基中使EBs单细胞贴壁培养。于第14～21天时，分别添加50μg/mL维生素C、50mmol/Lβ-磷酸甘油、1μmol/L地塞米松(A组)，50μ/mL维生素C、50mmol/Lβ-磷酸甘油、1μmol/L地塞米松、10n/mL骨形成蛋白2(B组)，并设不添加诱导剂对照组(C组)。第22天时用1％茜素红染色显示阳性细胞，计算成骨细胞诱导形成率，数据用方差分析和多重比较检验。
结果：成纤维细胞接种半小时后贴壁，可见细小突起长出，细胞呈梭形，核圆形。24小时后即可连生。ES细胞推开饲养层细胞生长，形成集落，集落边缘光滑清晰，有的集落边缘可见小的散在的ES细胞。细胞呈团状紧密排列，内部单个细胞辨别不清，每个细胞呈圆形，部分呈梭形，体积小，核大，胞浆少。细胞碱性磷酸酶染色呈强阳性，为二倍体核型，可形成类胚体。表明培养扩增后的细胞具有ESC的典型特征。在EBs单细胞贴壁培养的第14～21d加入成骨诱导剂后，细胞形态发生改变，原来的球形细胞逐渐发出突起，变为多角形或短梭形的类成纤维细胞样，茜素红染色为红色，证明己转化为成骨细胞。
结论：1.原代成纤维细胞分离方法简单，来源方便，细胞贴壁快，增殖迅速，作为饲养层能促进ES细胞的增殖并抑制其分化，因而非常适用于ES细胞的分离培养。2.维生素C、β-磷酸甘油、地塞米松、BMP-2组成的成骨诱导剂能够诱导ESC分化为成骨细胞，诱导分化率为29％左右。
胚胎干细胞;体外培养;成骨细胞;骨组织工程
山西医科大学
硕士
外科学
王东
2006
中文
R68;Q813
32
2007-06-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）