中华眼镜蛇毒组分C体外对人胶质瘤株的作用及机制研究
背景和目的:
脑胶质瘤是常见的颅内肿瘤，占脑恶性肿瘤的50％以上，目前脑胶质瘤的治疗，主要依赖手术切除，但是由于脑胶质瘤浸润性生长的特性，使得手术切除难以达到临床治愈的目的，级别较高的脑胶质瘤容易手术后复发或者脑内转移。为了达到良好的治疗结果，化疗作为脑胶质瘤综合治疗的一项重要手段，有着举足轻重的作用。但是血脑屏障的存在及脑胶质瘤对化疗药物敏感性的差异等因素，使脑胶质瘤化疗的临床效果不能不令人满意。
提高脑胶质瘤的化疗效果方法很多，通过新药研发、联合用药、局部用药甚至个体化用药等方法，使得脑胶质瘤的化疗效果有所提高。但是，迄今为止，脑胶质瘤的化疗效果仍然不能达到临床上防治复发的要求。这样，继续研发新药成了科研工作者的工作重点之一。为了能够节省科研经费及实验周期，选择对其他系统恶性肿瘤有效的化疗药物进行试验筛选，是切实可行的办法。中华眼镜蛇蛇毒组分C是已知的对多种恶性肿瘤有效的一种生物制剂。本课题的设计分为体外部分和体内部分，体外部分是用中华眼镜蛇蛇毒组分C(NajaNajaActraVenomFractionC,N.N.A.V.FC)对体外培养的脑胶质瘤细胞株U-251的药物毒性作用的研究，及用细胞生物学、免疫组织化学、分子生物学等方法研究该药物对脑胶质瘤细胞株U-251的作用机制；体内部分是用U-251瘤株接种到裸鼠，制造皮下荷瘤模型，然后通过体内药物试验，研究N.N.A.V.FC对脑胶质瘤的作用。为脑胶质瘤化疗药物的扩展作出探索。本文主要阐述N.N.A.V.FC在体外的药物作用及机制部分的研究。
材料和方法:
体外细胞毒性试验：
1.实验采用96孔板体外脑胶质瘤细胞株U-251的培养，分别加入N.N.A.V.FC时，应用四唑盐比色法，观察中华眼镜蛇蛇毒组分C对人胶质细胞瘤株U-251的细及其他临床化疗药物，加入药物后，分别培养24小时和28小时，应用四唑盐比色法，观察N.N.A.V.FC对人胶质细胞瘤株U-251的细胞毒作用、量效关系等，并观察N.N.A.V.FC与依托泊苷、鬼臼乙叉苷、卫萌(替尼泊苷、鬼臼甲叉甙)、顺铂、卡铂、五氟尿嘧啶等临床化疗药物的细胞毒作用差异。
2.96孔板体外培养正常的脑胶质细胞，分别加入不同浓度的N.N.A.V.FC，加入药物后，培养24小时，应用四唑盐比色法，观察N.N.A.V.FC对人正常胶质细胞的毒性作用、量效关系等，
毒理学作用机制的研究体外24孔板培养的脑胶质细胞瘤株U-251，加入不同浓度N.N.A.V.FC，形态学观察；3ug/ml药物浓度作用12小时后，固定，以免疫组织化学检测Fas,FasL、P53、bax/bcl2的表达；分别在3.0、4.5、15小时3个浓度点，培养4小时，在超净工作台上提取DNA，行DNALADDER实验。
结果:
1.N.N.A.V.FC组分在浓度为1.5μg/ml时，即对传代细胞株产生抑制作用，剂量越大，抑制作用越明显，本实验4.5ug/ml时，24h及48h的抑制率分别为57.4％和59％.24h及48hIC50分别为5.76和7.19ug/ml。
2.分析比较U-251细胞系对各药物的敏感性，对U-251的IC50，低浓度时N.N.A.V.FC的作用比替尼泊苷强(t＜0.05)；血浆峰浓度时的N.N.A.V.FC对U-251胶质瘤细胞毒性作用强于血浆峰浓度时依托泊苷、鬼臼乙叉苷、顺铂、卡铂、五氟尿嘧啶(P＜0.01)。
3.N.N.A.V.FC浓度与U-251胶质瘤细胞损伤程度呈正比，N.N.A.V.FC浓度在1.5ug/ml以下，U-251胶质瘤细胞的轮廓尚清晰，细胞形态无明显变化，胞体折光性好，细胞突起明显，N.N.A.V.FC浓度达3ug/ml时，细胞核固缩，细胞突起减少，胞体折光性减弱，胞浆内可见有颗粒，当N.N.A.V.FC浓度达4.5ug/ml时，U-251胶质瘤细胞轮廓变模糊，细胞变圆离壁，突起减少，变短，胞浆内颗粒明显增多，部分细胞涨大破裂。
4.Fas,FasL、P53、Bcl-2/Bax均有阳性表达，其中P53阳性表达率较高。
5.DNALADDER实验中有凋亡条带的出现，其中4.5ug/ml段条带最为清晰。
结论:
1.在本实验中，N.N.A.V.FC组分能有效抑制胶质瘤细胞株的生长，抑制作用与浓度呈正相关，与临床胶质瘤化疗药相比较，N.N.A.V.FC是有效的、能抑制胶质瘤细胞生长的药物。
2.形态学的观察结果显示，N.N.A.V.FC的改变，瘤细胞形态学的改变同IC50改变一致。
3.免疫组织化学结果与DNALADDER实验证实，N.N.A.V.FC对人脑胶质瘤株U-251的作用机制与细胞凋亡有关。
中华眼镜蛇;蛇毒组分C;免疫组织化学;脑胶质瘤;细胞毒;细胞凋亡;化学疗法
广州医科大学;广州医学院
硕士
外科学
李维平
2006
中文
R739.41;R979.1;R285.5
56
2006-12-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）