大鼠骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为肝细胞及体内移植后肝内定居的实验研究
本实验主要研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)在体外定向诱导分化为肝细胞能力，以及MSCs经门静脉体内移植后在肝内的定居情况。实验内容大致分为三部分，第一部分主要通过研究MSCs的生物学特性，建立分离和培养扩增细胞的方法，为以后的研究提供足够的细胞来源。第二部分主要研究MSCs在体外诱导体系的培养下向肝细胞分化的能力，是本课题的主要内容所在。第三部分主要研究未经诱导的MSCs门静脉移植后在肝内的定居能力，为今后研究细胞移植所需内环境奠定基础。
第一部分：大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性
目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分离和培养扩增的方法，研究MSCs的生物学特性，为利用MSCs作为种子细胞治疗多种疾病提供实验基础。
方法：通过密度梯度离心、贴壁筛选法分离培养大鼠MSCs，测定其接种贴壁率；在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化；利用MTT法测定MSCs生长曲线；应用流式细胞仪测定细胞周期并测定细胞表面标记物鉴定所培养的细胞；体外进行成骨诱导，检测细胞的多向分化特性。
结果：MSCs体外培养生长状况良好，具有活跃的增殖能力，接种10h后贴壁率为96％以上：细胞周期显示有91.4％处于G0/G1期；培养的MSCs阳性表达CD29、CD44、CD105，阴性表达CD34、CD45。经成骨诱导后MSCs表现出成骨细胞特性，合成碱性磷酸酶能力强，矿化结节逐渐出现。
结论：通过密度梯度离心、贴壁筛选法可在体外培养出高纯度的MSCs；在第8代之前的细胞生长稳定，增殖较快，细胞周期表现出较早期细胞特点，具有多向分化能力，可作为组织工程的种子细胞。
第二部分：大鼠骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为肝细胞的实
验研究目的：观察大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)在体外定向诱导分化为肝细胞的能力。
方法：通过密度梯度离心、贴壁筛选法分离、培养并纯化大鼠MSCs，取第3代细胞以5.0×105/cm2密度接种于六孔板内，每孔固定加入2ml含5％淤胆血清和肝细胞生长因子(HGF，终浓度25ng/ml)的DMEM培养基进行诱导分化；对照组为不加任何细胞因子的5％胎牛血清DMEM培养液进行培养。观察细胞形态的变化，并分别于7d和14d后进行荧光免疫染色和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)鉴定经诱导后细胞甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(ALB)的表达。
结果：诱导7d后的细胞由长梭形逐渐变为圆形，免疫荧光染色和RT-PCR检测见AFP表达，而未有ALB表达；诱导14d后，细胞呈现肝样细胞形态，ALB检测结果呈阳性，而AFP转为阴性。
结论：骨髓间充质干细胞在体外定向诱导后可分化为能分泌AFP和ALB的肝细胞。
第三部分：大鼠骨髓间充质干细胞移植后肝内定居的实验研究
目的：探索大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)同种异体移植后在受体大鼠模型肝内定居分布情况。
方法：利用密度梯度离心法分离、纯化培养大鼠骨髓间充质干细胞。取第3代MSCs经CFSE标记后，以1.0×106/ml细胞浓度从门静脉植入同种异体正常组和肝损伤组大鼠体内，于移植后的第14d取出的肝脏，通过冰冻切片行荧光检测，研究MSCs在大鼠肝脏内定居分布情况。
结果：经门静脉移植的MSCs在正常组和肝损伤组的肝脏内均能定居，肝损伤组肝脏定居的细胞数量上明显多于正常组。
结论：经门静脉移植的MSCs可以定居于肝脏内，且定居于肝脏的干细胞数量与肝脏是否损伤密切相关。
通过以上三部分研究，证实了MSCs具有干细胞自我更新和强大复制能力的生物学特性，具备成为种子细胞的先决条件；而经过体外特定的诱导体系诱导后的MSCs不但在形态上转变为肝样细胞，而且还能分泌肝细胞特性蛋白，如ALB和AFP，初步认为MSCs具有向肝细胞分化的能力；MSCs体内移植后能定居于肝脏内，同时发现，当肝脏损伤程度加重时，定居的细胞数目也随之增多，证实移植细胞定居于肝脏的数目于细胞所处的内环境关系密切。
骨髓间充质干细胞;生物学特性;细胞培养;淤胆血清;肝细胞;细胞移植
广州医科大学;广州医学院
硕士
外科学
陈斌
2006
中文
R657.3
67
2006-12-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）