腺病毒介导CⅡTA突变体基因转移防治实验性自身免疫性甲状腺炎的研究
实验性自身免疫性甲状腺炎(experimentalautoimmunethyroiditis，EAT)由于与人类桥本甲状腺炎具有相似的病理特征与疾病进程，因此常作为研究桥本甲状腺炎发病机理的动物模型。EAT是一种T细胞介导的以甲状腺上皮细胞变性、坏死、纤维化并伴有大量单个核细胞浸润为病理特征的免疫性炎症。在甲状腺组织中，MHC-Ⅱ类分子异常表达，CD4+T细胞和巨噬细胞大量局部浸润、致炎因子分泌增加，导致抗甲状腺球蛋白自身反应性T细胞的激活是造成正常甲状腺损伤的主要原因。因此，有可能通过靶向性抑制CⅡTA的表达，下调MHC-Ⅱ类分子的表达及其对自身抗原肽的递呈，达到对EAT进行防治的目的。
有鉴于此，本研究旨在：(1)通过构建CⅡTA突变体的重组腺病毒，观察其对MHC-Ⅱ类分子组成性和诱导性表达的抑制作用；(2)研究CⅡTA突变体基因转移在预防和治疗EAT中的效果及其可能机制。
本研究设计了一种小鼠Ⅳ型CⅡTA的突变体，造成其N-端第109-226位氨基酸的缺失突变。用常规分子生物学方法和重叠延伸PCR法(OE-PCR)构建了该突变体的两种腺病毒表达载体(pAdEasy-1系统)，即pAd-CMV-CⅡTAm和pAd-pⅣ-CⅡTAm；腺病毒载体经HEK293细胞包装产生含CⅡTA突变体的重组腺病毒Ad-CMV-CⅡTAm和Ad-pⅣ-CⅡTAm，用氯化铯密度梯度离心法获得纯化的高滴度腺病毒；采用多种方法对重组腺病毒进行了定量检测与活性评价；并将Ad-CMV-CⅡTAm和Ad-pⅣ-CⅡTAm分别感染SVEC细胞与J774细胞，观察其对诱导性与组成性MHC-Ⅱ类分子表达的抑制；用纯化的猪甲状腺球蛋白免疫CBA/J小鼠，诱导实验性自身免疫性甲状腺炎模型的产生，并分别于免疫后0～2天与14～16天经尾静脉注射重组腺病毒，观察CⅡTA突变体对实验性自身免疫性甲状腺炎的预防与治疗效果及其机制。
本研究包括三个部分：
第一部分CⅡTA突变体重组腺病毒载体的构建、扩增、纯化和滴度测定本部分内容中有关重组腺病毒的构建和包装的实验内容由本实验室2005届硕士研究生管政完成。采用重叠延伸PCR法(OE-PCR)造成CⅡTA基因N端第325-678位碱基的缺失突变，克隆到pIRES上，得到重组质粒pIRES-CⅡTAm。构建Ad-CMV-CⅡTAm时，将pIRES-CⅡTAm克隆到pAdTrack穿梭质粒上，经PmeI线性化后转入BJAdEasy-1感受态菌中进行同源重组，获得pAd-CMV-CⅡTAm重组腺病毒骨架质粒。构建Ad-pⅣ-CⅡTAm时，先构建重组穿梭质粒pShuttle-pⅣ并将CⅡTAm克隆到其中，得到pShuttle-CⅡTAm-pⅣ，经PmeI线性化后转入BJAdEasy-1感受态菌中进行同源重组，获得pAd-pⅣ-CⅡTAm重组腺病毒骨架质粒。将pAd-CMV-CⅡTAm和pAd-pⅣ-CⅡTAm分别转染HEK293细胞，当出现明显细胞病变时收获培养上清及细胞反复冻融后的细胞裂解液上清，获得完整的病毒颗粒。
本部分构建的重组腺病毒载体为进行显性失活CⅡTA突变体抑制CⅡTA基因表达，定量下调MHC-Ⅱ类分子的表达，以及防治自身免疫性疾病动物模型打下了基础。
通过半数组织细胞病变法(TCID50)、流式细胞术和实时荧光定量PCR法测定了经CsCl双密度梯度超速离心纯化的重组腺病毒的感染活性与实际病毒颗粒数。两组方法之间的差距平均不超过102倍，且两组方法内之间的结果具有明显的可比性，表明了经纯化的重组腺病毒具有较稳定的性质。由于测定感染活性的方法往往缺乏客观的判断标准，且耗时耗力，较易引起误差，而测定病毒实际颗粒数的方法又不能反映病毒的感染活性，因此我们推荐在测定病毒滴度时运用多种方法联合评价。由于我们纯化的病毒活性比较高，为了保持后续实验的重复性，我们使用了实际病毒颗粒数作为剂量标准。
第二部分CⅡTA突变体重组腺病毒的表达调控和体外功能研究
本部分首先使用小鼠IFN-γ分别对小鼠血管内皮细胞株SVEC和小鼠巨噬细胞株J774进行刺激，观察IFN-γ对MHC-Ⅱ类分子表达的作用。发现小鼠IFN-γ能够诱导SVEC细胞表达MHC-Ⅱ类分子(IAk)，且随剂量的增大而使其表达升高；J774细胞组成性表达MHCⅡ类分子(IAd)，但小鼠IFN-γ对J774细胞MHC-Ⅱ类分子的表达有明显增强作用。分别用重组腺病毒Ad-CMV-CⅡTAm和Ad-pⅣ-CⅡTAm转染SVEC和J774细胞，同时以空载病毒Ad-GFP作为对照，观察它们对诱导性与组成性MHC-Ⅱ类分子表达的抑制作用，同时观察野生型CⅡTAmRNA(CⅡTAwt)和突变型CⅡTAmRNA(CⅡTAm)表达的差异。研究发现，脂质体介导Ad-CMV-CⅡTA和Ad-pⅣ-CⅡTAm转染J774细胞后，表达MHC-Ⅱ类分子的细胞阳性率明显下降；Ad-CMV-CⅡTA和Ad-pⅣ-CⅡTAm感染SVEC细胞后，对IFN-γ刺激作用的敏感性明显降低，表达MHC-Ⅱ类分子的细胞阳性率显著降低。上述结果证实了重组腺病毒Ad-CMV-CⅡTA和Ad-pⅣ-CⅡTAm能够有效抑制组成性与诱导性MHC-Ⅱ类分子的表达。实时定量RT-PCR同时检测这些细胞中CⅡTAwt、CⅡTAm的mRNA表达水平，发现CⅡTAwt的表达受ⅡFN-γ的明显诱导或增强，且腺病毒转染对CⅡTAwtmRNA表达水平影响不大。这说明，CⅡTA突变体抑制MHCⅡ类分子的表达，并不是通过减少CⅡTAwt的转录来实现的。我们认为，可能是野生型CⅡTA与MHCⅡ启动子区上的稳定小体的结合受到突变型CⅡTA蛋白的强烈竞争，从而降低了MHCⅡ类分子的转录活性。Ad-CMV-CⅡTAm感染或转染细胞后，CⅡTAmmRNA有较高水平的表达，而Ad-pⅣ-CⅡTAm感染或转染细胞后，CⅡTAmmRNA表达水平很低，需IFN-γ刺激才能有高水平表达。这证实Ad-pⅣ-CⅡTAm中CⅡTAmmRNA的表达是IFN-γ依赖性的。
第三部分腺病毒介导CⅡTA突变体基因转移防治实验性自身免疫性甲状腺炎的研究
选择6周龄的CBA/J小鼠，分别于0天和第7天皮下注射100μg纯化的猪甲状腺球蛋白及CFA/IFA，制备实验性自身免疫性甲状腺炎动物模型。分别于初次免疫后0～2天与14～16天经小鼠尾静脉注射重组腺病毒Ad-CMV-CⅡTAm和Ad-pⅣ-CⅡTAm(单次剂量为5×109Vp/只)作为预防实验组与治疗实验组，并同时以空载病毒Ad-GFP作为其各自的对照组，再设立单纯免疫组与正常组对照。小鼠于初次免疫后第28天眼球取血后，脱颈处死，解剖获取甲状腺与脾脏。甲状腺病理检查判断甲状腺病损程度，测定小鼠血浆抗甲状腺球蛋白抗体的滴度与总IgG的量判断小鼠的体液免疫功能，测定小鼠脾脏单个核细胞对ConA和甲状腺球蛋白刺激的增殖能力及细胞因子的分泌能力反映小鼠细胞免疫功能，免疫组化测定小鼠甲状腺组织中浸润单个核细胞与甲状腺组织中MHC-Ⅱ类分子的表达，流式细胞术测定脾及外周血的淋巴细胞亚群与MHC-Ⅱ类分子、ICOS的表达。
结果显示：在预防性实验组，以Ad-CMV-CⅡTAm处理的小鼠甲状腺病损程度明显减轻，诱导表达的MHC-Ⅱ类分子明显受抑，自身抗体与总IgG水平均明显下降，脾单个核细胞对甲状腺球蛋白的刺激明显受抑，外周血与脾脏中活化T细胞上的MHC-Ⅱ类分子的表达及活化T细胞数均明显减少，细胞因子IFN-γ和IL-2降低。这表明早期使用重组腺病毒Ad-CMV-CⅡTAm能够有效防止自身免疫性甲状腺炎的发生。在治疗性实验组，以Ad-CMV-CⅡTAm处理的小鼠表现出甲状腺病损程度减轻、脾单个核细胞对甲状腺球蛋白刺激的应答明显受抑，自身抗体的滴度明显下降，活化T细胞上的MHC-Ⅱ类分子的表达量及活化T细胞数均明显减少，但甲状腺滤泡细胞上仍有一定水平的MHC-Ⅱ类分子的表达。这些结果表明发病后应用Ad-CMV-CⅡTAm治疗能够明显减轻甲状腺炎的病损程度，对甲状腺炎具有一定的治疗效果。
以Ad-pⅣ-CⅡTAm代替Ad-CMV-CⅡTAm进行预防或治疗EAT，结果显示Ad-pⅣ-CⅡTAm的效果接近Ad-CMV-CⅡTAm，能有效预防及治疗EAT。这说明CⅡTAm基因在pⅣ启动子调控下，在EAT病理发生过程能有效表达，并发挥抑制MHC-Ⅱ表达及其抗原递呈功能，进而减轻EAT的病理程度。
在本研究中，我们使用的Ad-CMV-CⅡTAm和Ad-pⅣ-CⅡTAm在不同病理时期对EAT进行预防或治疗均取得了较好的效果，这为临床治疗桥本甲状腺炎提供了有意义的启示。
实验性自身免疫性甲状腺炎;MHC-Ⅱ;CⅡTA;腺病毒;基因治疗;桥本甲状腺炎;发病机理;动物模型
第二军医大学
博士
临床检验诊断学
沈茜
2006
中文
R581.4
108
2006-12-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）