可诱导共刺激分子重组蛋白的研制及其在过敏性哮喘炎症中的治疗作用
本课题采用基因工程重组DNA技术克隆ICOS活性片段、构建ICOS-mIg融合基因真核表达载体，在哺乳动物细胞中实现ICOS-mIg的高效表达，并通过亲和层析技术纯化重组蛋白；在此基础上，进行了ICOS-mIg体内外生物学功能的研究；观察了ICOS-mIg阻断共刺激通路对过敏性哮喘炎症的影响；采用Insightll分子模拟的方法和配体亲和筛选突变点，并构建、表达获得配体高结合活性ICOS突变体融合蛋白，用异基因混合淋巴细胞增殖抑制试验检测突变体蛋白的生物学活性；另外经过反复实验，完成了基因工程人源ICOS-Ig的纯化工艺研究，其结果符合生物制品检定要求。
主要结果
1.基因工程重组ICOS-mIg表达系统的构建及其生物活性研究
从受凝集素刺激后的人外周血单个核细胞中提取总RNA，以RT-PCR方法获取编码ICOS成熟蛋白胞外片段的cDNA，；将人ICOS胞外片段基因与小鼠免疫球蛋白重链基因在pGL3-basic克隆载体中连接成融合基因，并将ICOS-mIg融合基因插入真核分泌型质粒pSecTaq2/HygroA，构建表达质粒pSecTaq2/HygroA-ICOS-mIg，转化CHO细胞，经过抗生素筛选，获得稳定、高效表达细胞株，实现ICOS-mIg融合蛋白的表达；ELISA鉴定表达量可达100mg/L；用亲和层析方法纯化的蛋白能明显抑制异基因小鼠的混合淋巴细胞反应和淋巴细胞分泌细胞因子。这部分工作中，制备人源ICOS活性片段和小鼠免疫球蛋白片段的融合蛋白，并实现哺乳动物的真核表达在国内尚未见报道，为实验研究B7RP-1/ICOS共刺激通路生物学功能与应用打下了良好的基础。
2.ICOS-mIg对过敏性哮喘炎症的治疗作用
取健康雌性BALB/c小鼠用分段随机分组法将小鼠随机分成6组，每组8只，分别为CTLA4-Ig/ICOS-mIg联合治疗组(A组)、CTLA4-Ig治疗组(B组)、ICOS-mIg治疗组(C组)、哮喘组(D组)、生理盐水气雾激发对照组(E组)、同型抗体对照组(F组)；建立鸡卵白蛋白(OVA)免疫BALB/c小鼠哮喘模型；给予ICOS-mIg、CTLA4-Ig、CTLA4-Ig/ICOS-mIg联合治疗后，观察哮喘小鼠气道压力变化、支气管肺泡灌洗液中细胞总数、各炎性细胞百分比及IL-4、IFN-γ和IgE含量的变化；采用FACS检测Th亚群变化；取肺组织行病理组织学分析观察肺内炎症情况。
结果显示：(1)D组小鼠的气道压力(58±10％)较E、F对照组明显增高(27±5％、33±9％，P＜0.01)；A组(32±5％)、B组(26±5％)和C组(33±12％)较D组小鼠的气道压力显著降低，其中B组的气道压力降低最明显，差异有统计学意义。(2)各组小鼠BALF中的细胞计数、分类结果表明，D组小鼠的细胞总数(23±5×107/L)、中性粒细胞(1.8±1×107/L)、单个核细胞(5.6±2×107/L)和嗜酸性粒细胞(1.6±0.7×107/L)较E、F对照组明显增高；嗜酸性粒细胞分类结果表明：A组(0.3±0.2×107/L)、B组(0.2±0.1×107/L)和C组(0.1±0.3×107/L)较D组显著下降，A、B、C个处理组之间无显著差异；单个核细胞分类结果表明：A组(1.2±0.6×107/L)、B组(1.0±0.5×107/L)和C组(1.1±0.8×107/L)较D组显著下降，A、B、C个处理组之间及各对照组间均无显著差异；中性粒细胞分类结果各实验组间无显著差异。(3)外周血总IgE水平的检测结果表明：D组小鼠外周血总IgE水平(282±21μg/L)较E、F组(9.3±1.7、12.2±2.6μg/L)显著升高；A组(128±13μg/L)、B组(100±17μg/L)和C组(175±33μg/L)均较D组显著下降，其中C组水平最低。(4)各组小鼠BALF中细胞因子含量的检测结果表明：D组小鼠BALF中IL-4水平(179±44ng/L)较E、F组(81±12ng/L、61±23ng/L)显著升高；B组的IL-4水平(106±29ng/L)和C组(77±31ng/L)较D组明显降低，其中C组下降最明显；A组(171±67ng/L)与D组相比无显著差异。IFN-γ含量检测结果表明：D组小鼠BALF中IFN-γ水平(615±133ng/L)较E、F组(1019±84ng/L、1021±122ng/L)显著降低；C组(606±123ng/L)与D组无明显差异。(5)Th1、Th2亚群的检测结果表明：外周血和脾脏的Th2亚群比例D组(11.1±2.5％、7.21±0.89％)均明显高于E、F组；A组(7.6±1.8％、5.75±0.96％)、B组(4.2±1.6％、4.85±0.69％)、C组(4.5±1.0％、4.88±0.67％)均低于D组，其中B、C组水平最低。外周血和脾脏的TH1亚群比例各组间均无显著差异。
3.ICOS突变体融合蛋白的构建和生物学功能的鉴定
哺乳动物细胞表达ICOS-mIg的生产工艺复杂，来源比较困难而且成本高、体内用量大，限制了ICOS-mIg的研究和应用。随着共刺激分子配、受体分子结构和晶体结构研究的深入，这些信息为基因工程设计和改造天然免疫活性分子以提高其生物学活性提供了基础。大量研究表明通过筛选突变型免疫活性蛋白可以获得特异性活性目的蛋白。我们根据蛋白质数据库中获得CTLA4和配体B7-1/B7-2的复合物晶体结构，以其为模板，利用Insightll分子模拟软件所提供的生物信息学方法对rhICOS突变体结构进行模拟分析，制备高配体结合活性的ICOS突变体融合蛋白。结果确定了一个单点(Q59K)的定点氨基酸突变和配体亲和活性筛选。对获得的rhICOS突变体克隆的活性进行功能评价，将有可能提高ICOS融合蛋白与配体结合和增加其生物学活性。
4.重组ICOS-Ig生产工艺的初步研究
制备人ICOS胞外片段与人IgG1重链恒定片段融合基因真核表达载体，转染工程细胞株CHO-K1，抗生素筛选稳定、高效表达细胞株，无血清培养制备重组蛋白，收集细胞上清，采用亲和层析技术和分子筛技术分离纯化重组蛋白；SDS-PAGE电泳、HPLC纯度分析检测蛋白纯度，蛋白质N端测序，肽谱图分析，蛋白分子量测定，等电点测定，活性测定均符合理论和生物制品检定的要求。
结论:
1.成功制备具有配体结合活性和T淋巴细胞功能抑制活性的ICOS-mIg重组蛋白。
2.ICOS-mIg重组蛋白治疗的哮喘小鼠气道压力减小、气道炎性细胞浸润减轻，BALF中炎性细胞及嗜酸粒细胞数目减少，说明ICOS-mIg可以抑制哮喘小鼠的气道炎症反应并且可以缓解症状。ICOS-mIg与CTLA4-Ig联合治疗可以明显减少OVA过敏性哮喘小鼠肺部的炎性渗出和浸润及气道阻力；可以减少BALF中炎性细胞的数量；与单独用药相比，无明显差异。与ICOS-mIg的作用相比，虽然无统计学上的差异，但从数值上看，联合用药后，脾脏、外周血中的Th2亚群比例升高，BALF中IL-4水平下降，IFN-Y水平升高。在急性OVA过敏性哮喘小鼠模型中，ICOS-mIg和CTLA4-Ig联合用药的效果不明显优于ICOS-mIg或CTLA4-Ig。
4.采用分子模拟和配体亲和筛选的方法确定了一个单点(Q59K)的定点氨基酸突变，体外异基因混合淋巴细胞抑制实验验证携带该突变点的ICOS59K-mIg融合蛋白的生物学活性优于野生型ICOS-mIg。
5.ICOS-Ig重组蛋白生产工艺的初步研究表明：ICOS-Ig重组蛋白的理化指标的检测均符合理论数据和生物制品检定的要求，本实验摸索出的制备和纯化工艺适合于后续中式生产应用的ICOS-Ig。
过敏性哮喘;可诱导共刺激分子;重组蛋白;分子模拟;突变体蛋白
第二军医大学
博士
临床检验诊断学
沈茜
2006
中文
R562.25
102
2006-12-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）