人功能基因表达谱筛选肝癌高表达基因及asph功能初步研究
原发性肝癌(简称肝癌，Hepatocellularcarcinoma，HCC)是我国最常见的高发肿瘤之一，近年来肝癌的病死率又有上升趋势，已成为我国第2位恶性肿瘤致死原因，可见我国肝癌高发的形势十分严峻。尽管肝癌治疗的新技术和新方法层出不穷，肝癌研究已取得了很大的进步，疗效也已得到明显改观，但就肝癌整体而言，其疗效仍很不理想。影响疗效的主要因素是转移复发。目前对肝癌转移复发的机制了解不甚明确，可能涉及血管生成、细胞黏附、细胞凋亡、基因突变等多方面因素。近年来发展的cDNA芯片(cDNAchip或microarray)、组织微阵列(tissuemicroarray，TMA)等技术，具有多样品并行处理能力，分析速度快，所需样品少，近年来成为分子生物学、肿瘤学研究领域常用方法。本研究在对肝癌进行功能基因筛选同时，建立肝癌组织芯片技术并加以应用，进一步对肝癌组织及肝癌细胞系中明显高表达基因ASPH进行RNA干扰研究，初步研究ASPH基因在肝癌中的作用。
第一部分：原发性肝癌(HCC)功能基因表达研究。利用含有5075个功能基因cDNA的人表达谱芯片，将6例原发性肝癌患者分成癌和癌旁两组，分别提取标本的癌、门静脉癌栓和癌旁组织，抽提总mRNA,反转录为cDNA与芯片进行杂交，对比mRNA表达的差异，癌和癌旁的基因表达差异，得到癌组织中明显高表达的ASPH、FACL4、MPK4K4、HSF-1、DAP3等基因210个，低表达基因MT-1X等424个基因。41例肝癌及四株肝癌细胞(HepG2、SMMC-7721、MHCC-H、MHCC-L)进行RT-PCR检测，发现ASPH表达在肝癌及肝癌细胞株中仍明显高表达。41例肝细胞癌以及相对应的癌旁肝组织的mRNA采用半定量RT-PCR检测显示ASPH基因在癌组织中36例(87.8％)明显高表达(光密度比值＞2)，癌旁组织ASPH基因mRNA表达为中等程度或低度表达。41例肝癌组织中ASPH基因mRNA表达量的光密度比值为2.5±1.1，癌旁肝组织中ASPH基因mRNA表达量的光密度比值为1.0±0.7，t检验分析显示有非常显著意义(P＜0.01)。
第二部分：构建肝癌组织芯片及应用。共取标本350例，其中肝细胞癌315例，胆管细胞癌7例，混合型肝癌6例，肝良性肝占位或肝脏病变17例，转移性肝脏恶性肿瘤5例，均为本院2004年外科手术标本，包括肿瘤组织和相应的瘤旁组织、癌栓组织；另外10例正常肝组织均为尸检取材标本。对每例组织标本，先在HE切片上确定典型的肿瘤和相应的正常组织，并在相应的蜡块上作好标记，根据要求选择不同大小孔径的穿刺针，将组织按一定规则转移至长宽高约45mm×28mm×15mm的蜡块中，得到TMA蜡块共14块，其中为9×7、9×7、16×8、16×9、16×8、16×10、17×9阵列各两块，制备肝癌组织芯片700余张。其中两张9×7点阵中包含有癌、癌旁、正常肝、癌栓组织，其余均为癌和癌旁组成的点阵。取组织芯片库中三张芯片，免疫组织化学方法检测ASPH产物的表达，并与临床和预后相联系。ASPH免疫组化染色阳性颗粒位于肝细胞癌组织细胞膜和胞浆内，细胞核周亦可见染色。癌旁组织ASPH免疫组化染色为弱阳性或阴性。302例肝细胞癌中280例ASPH抗体免疫组化反应为阳性(93％)，肝细胞癌中ASPH蛋白高表达与肝内转移(包括门静脉癌栓形成)有关(P=0.035)、与分化程度有关(高分化与中等分化：P=0.019；高分化与低分化、P=0.007)。然而ASPH蛋白表达在其它的临床及病理特征，如年龄、血浆AFP水平、肝硬化、肿瘤包膜等等上并无区别。
第三部分：以ASPH为靶基因在HepG2、Hep3B中研究RNA干扰效果。ASPH全名天冬氨基β羟化酶(aspartateβ-hydroxylase、aspartylβ-hydroxylase)基因，也简称为BAH、HAAH。其编码产生五种同源蛋白质(a，b，c，d，e)，其中同源蛋白a含758个氨基酸，具有酶活性，而b、c、d、e为膜蛋白，与钙离子结合、释放有关。在小鼠、大鼠和人类中发现其具有高度保守特性。研究发现，在小鼠中，ASPH基因编码产生三个独立的蛋白：iunctin、humbug、BAH。ASPH是一种依赖α酮基双氧化酶，对含有EGF(表皮生长因子)样区域中的天门冬氨酸或天门冬酰胺残基起羟化作用(转录后水平)，而这种含有天门冬氨酸/天门冬酰胺残基羟化的区域高度保守、广泛存在于一些蛋白质中：凝集因子Ⅶ、Ⅸ、X、Notch受体和配体、受体酪氨酸激酶tyro-3/Axl家族的配体、细胞外基质结构蛋白等等。有报道ASPH敲除的裸鼠多种组织蛋白表达缺失，尤其在肝组织检测不到其产物酶活性存在、凝集因子X无法活化，雌性裸鼠生育能力下降，而且裸鼠出现并指、面部畸形、腭裂等等。这些发育缺陷与Notch配体Jagged-2基因敲除或减效基因表达效果相似，另有报道人的Notch配体Jagged-1的EGF样区域也是靠ASPH羟化的。Notch基因家族成员的EGF样区域转录后修饰对Notch信号途径发挥作用有明显影响。在一些人类肿瘤组织中发现ASPH表达水平增高，见诸于报道的有肝胆管细胞癌、胰腺癌、大肠癌肝转移等，在肝癌中的研究亦有报道10例肝细胞癌中4例高表达ASPH，其与肝细胞癌的发生发展、转移复发究竟关系如何尚无进一步研究。因此运用反义遗传方法(RNAinterference，RNAi)对ASPH功能作进一步研究，以增加对其在肝癌中功能的认识。RNAi是通过双链RNA(dsRNA)介导的特异性地降解相应序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。相对基因打靶而言，RNAi是一种非常有效而又简单易行的基因敲除方法，在特异性高效性抑制基因功能方面显示了广阔的前景。目前RNAi技术被应用在癌基因等功能的研究中，并已取得对某些基因的RNAi，这为基因功能的研究提供了一种崭新的方法，而且为肿瘤的预防和治疗提供了新的方法和思路。在293T细胞中，转染过表达目的基因后，采用检测RFP融合蛋白荧光水平的实验方法，在蛋白水平检测目的基因在不同的RNAi靶点干扰情况下的敲减效率。针对外源转染表达的蛋白质，我们采用Invitrogen的Lipofectamine2000Kit进行质粒和不同靶点化学合成siRNA的共转染导入，检测不同靶点RNAi的敲减效率。每次实验针对每个RNAi靶点设计一对重复，并平行设定转染组和阴性对照RNA干扰的两组对照实验。2号靶点对外源表达的目的基因，在RFP融合蛋白水平均有明显knockdown作用。我们把这个特异性2＃siRNA转染高表达ASPH肝癌细胞系HepG2、SMMC、Hep3B对其进行比较分析。不同的转染终浓度进行比较，Real-timePCR验证mRNA的水平，发现终浓度为150nM时基因消减率达50％-70％左右。联合Westernblot结果，显示瞬时siRNA转染干扰基因的表达是可行的。Asph基因RNAi后，MTT试验显示肝癌细胞均呈增值力减弱，提示细胞生长存在阻滞或/和凋亡现象。细胞划痕实验证实细胞爬行能力减弱。ASPH消减后Westernblot结果检测ASPH蛋白表达水平相应下降，p53、PCNA、EGFR、Her-2等蛋白表达，发现PCNA表达下降。这些结果互相验证，说明RNAi可以在体外抑制肝癌细胞的群体增值能力。
我们对ASPH在肝癌中的作用进行了初步探讨，认为该基因与肝癌细胞的增殖、迁移、粘附等性能相关，可能通过这些机制促进肝癌的维持、生长、转移，具体的机制尚有待于进一步研究。
综上所述，基因芯片、组织芯片为高通量、快速筛选疾病相关基因提供了技术支持，RNAi是进几年才发现的一种反向遗传研究方法，为后基因组时代的基因功能研究及其基因治疗提供了一种崭新的、强大而又有效的平台。我们在研究筛选得到的一个特异性高表达基因ASPH时建立了肝癌组织芯片库，筛选出有效的siRNA并加以初步验证，对ASPH基因在人肝癌细胞中的作用得到初步的结果，为后续工作奠定了基础。
肝癌;基因表达;异常基因;蛋白表达;基因治疗
第二军医大学
博士
外科学
沈锋;吴孟超
2006
中文
R735.7
111
2006-12-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）